let-7a抑制巨噬細(xì)胞浸潤和尤文肉瘤惡性生物學(xué)的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：目前研究認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞、腫瘤分泌的細(xì)胞因子和骨髓骨微環(huán)境之間的相互作用在骨腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著不可或缺的作用。在腫瘤基質(zhì)細(xì)胞中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophages, TAMs)在數(shù)量和功能上具有重要的地位。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在尤文肉瘤組織中存在大量的TAMs浸潤，另外，本課題組已研究證實(shí)let-7a在尤文肉瘤充當(dāng)抑癌基因的角色，可以抑制尤文肉瘤的生長。但在尤文肉瘤中，let-7a是否與巨噬

2、細(xì)胞的浸潤相關(guān)?目前未見相關(guān)報道，針對這一問題，我們進(jìn)行了相關(guān)的研究。
　　研究目的：探討let-7a對尤文肉瘤巨噬細(xì)胞浸潤和尤文肉瘤惡性表型的影響及其機(jī)制。
　　方法：首先，Real-time PCR檢測let-7a在16例尤文肉瘤組織及細(xì)胞的相對表達(dá)量；免疫組化檢測尤文肉瘤組織TAMs CD68+細(xì)胞的浸潤程度，并與let-7a表達(dá)量行相關(guān)性分析；單核細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)檢測尤文肉瘤過表達(dá)let-7a對外周血單核細(xì)胞趨化的影響；

3、CCK-8法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)以及單核細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)分別檢測尤文肉瘤細(xì)胞過表達(dá)let-7a后對其增殖、遷移、侵襲以及外周血單核細(xì)胞募集能力的影響；生物信息學(xué)分析let-7a靶基因預(yù)測結(jié)果，確定候選靶基因，雙熒光報告試驗(yàn)、Rescue實(shí)驗(yàn)以及Western Blotting實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證let-7a的靶向作用；最后，構(gòu)建尤文肉瘤裸鼠荷瘤模型，局部注射觀察let-7a mimic對瘤體生長的影響以及對巨噬細(xì)胞浸潤的影響，并進(jìn)行相

4、關(guān)分析。
　　結(jié)果：Real-time PCR結(jié)果顯示let-7a在尤文肉瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)下降，免疫組化結(jié)果顯示尤文肉瘤組織高表達(dá)TAMs標(biāo)志物CD68，巨噬細(xì)胞的浸潤程度與let-7a的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，這些結(jié)果提示let-7a在尤文肉瘤可能充當(dāng)抑癌基因的角色，并參與調(diào)節(jié)尤文肉瘤組織巨噬細(xì)胞的浸潤；細(xì)胞功能學(xué)性實(shí)驗(yàn)證實(shí)，過表達(dá)let-7a可以顯著抑制其增殖、遷移、侵襲以及對外周血單核細(xì)胞的募集能力；生物信息學(xué)分析我們確定信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

5、與轉(zhuǎn)錄激活因子3（Signal transducer and activator of transcription-3, STAT3）為我們感興趣的靶基因，雙熒光報告實(shí)驗(yàn)、Rescue實(shí)驗(yàn)及Western Blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)STAT3為let-7a的直接靶基因，let-7a通過直接靶向STAT3介導(dǎo)抑癌以及對巨噬細(xì)胞募集的作用；最后，裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)let-7a的表達(dá)可明顯地抑制瘤塊的生長以及巨噬細(xì)胞的浸潤，同時靶基因S