MicroRNA-101對骨肉瘤細胞凋亡和侵襲等生物學特性的影響及機制研究.pdf

1、第一部分MicroRNA-101在人骨肉瘤組織和細胞中的表達變化
　　目的：探討人骨肉瘤組織和細胞中miRNA-101的表達變化及臨床意義。
　　方法：收集華中科技大學附屬協(xié)和醫(yī)院骨科骨腫瘤組織庫31例人骨肉瘤組織標本和31例非髖關(guān)節(jié)腫瘤疾病行髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后的正常骨組織標本（骨膜組織），應用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）的方法檢測31例人骨肉瘤組織標本和31例正常骨組織標本的miRNA-101表達變化；同時應用qRT-

2、PCR方法檢測人骨肉瘤細胞系MG63細胞、Saos-2細胞和人成骨細胞系hFOB1.19細胞miRNA-101的表達變化。
　　結(jié)果：MiRNA-101在31例骨肉瘤組織和正常骨組織中的均有表達，骨肉瘤組織中miRNA-101的表達顯著低于正常骨組織，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；MiRNA-101在人骨肉瘤細胞系MG63細胞、Saos-2細胞和人成骨細胞系hFOB1.19細胞中同樣有表達，且成骨細胞miRNA-101的表達顯

3、著高于骨肉瘤細胞MG63和骨肉瘤細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而骨肉瘤細胞MG63和Saos-2中miRNA-101的表達無統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論：與正常骨組織及成骨細胞相比，骨肉瘤組織及骨肉瘤細胞中miRNA-101的表達顯著減低，miRNA-101可能參與了骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　第二部分 MicroRNA-101對骨肉瘤細胞生物學特性的影響體外實驗研究
　　目的：探討miRNA-101對人骨肉瘤細胞增殖

4、、凋亡、細胞周期、侵襲以及遷移等的生物學特性的影響。
　　方法：以LipofectamineTM2000為載體，將miRNA-101模擬物及miRNA-101陰性對照模擬物瞬時轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細胞系MG63細胞中。實驗分組設計成三組分別為空白對照組、模擬物陰性對照組以及miRNA-101模擬物轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染后通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，實時熒光定量PCR檢測三組細胞miRNA-101的表達，MTT法檢測不同時間點三組細胞的增殖，流式細胞

5、儀檢測三組細胞的凋亡及細胞周期變化，Transwell實驗和劃痕實驗分別檢測三組細胞的侵襲及遷移能力。
　　結(jié)果：瞬時轉(zhuǎn)染24h后，通過熒光顯微鏡下觀察各組細胞的轉(zhuǎn)染效率，當70％以上的細胞內(nèi)有熒光分布時此組細胞可行相關(guān)指標檢測。轉(zhuǎn)染48h后收集細胞，qRT-PCR檢測三組細胞miRNA-101的RQ值分別是空白對照組（1.31±0.32）、陰性對照組（1.35±0.31）和miRNA-101模擬物組（3.86±0.28）。模擬物

6、轉(zhuǎn)染組miRNA-101的表達較空白對照組和陰性對照組明顯上調(diào)，相應增加了2.95倍和2.86倍，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而陰性對照組與空白對照組相比，miRNA-101表達差異無統(tǒng)計學意義（P=0.87）。MiRNA-101的mRNA表達量明顯上調(diào)，表明轉(zhuǎn)染組骨肉瘤MG63細胞成功轉(zhuǎn)染了miRNA-101模擬物。與陰性對照組和空白對照組相比較，miRNA-101模擬物轉(zhuǎn)染組腫瘤細胞的增值速率明顯降低，凋亡率增高，細胞周期停滯

7、在G1期前（細胞周期阻滯），腫瘤細胞侵襲和遷移能力明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論：MiRNA-101可明顯抑制骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，促進骨肉瘤細胞凋亡，誘導骨肉瘤細胞發(fā)生周期阻滯。MiRNA-101可能是一種骨肉瘤抑癌基因，參與骨肉瘤的發(fā)生、進展。
　　第三部分 MicroRNA-101靶基因的預測及驗證實驗研究
　　目的：探尋miRNA-101調(diào)控人骨肉瘤細胞生物學特性改變的可能靶基因，分析miR

8、NA-101發(fā)揮調(diào)控作用的可能機制，為深入研究miRNA-101的調(diào)控機制奠定理論基礎。
　　方法：利用TargetScan、miRecord和Pictar等生物信息學在線網(wǎng)站預測miRNA-101的靶基因，篩選miRNA-101的候選靶基因。確認哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）為候選靶基因之一，擴增包含候選靶基因
　　3'-UTR的基因片段（3'-UTR-mTO

9、R-Wt）并將其亞克隆至熒光素酶報告基因pGL3載體上（pGL3-3'-mTOR-Wt）并對此重組載體進行定點突變構(gòu)建為pGL3-3'-UTR-mTOR-Mut載體。利用熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miRNA-101與候選靶基因mTOR的結(jié)合情況，明確其是否為miRNA-101的作用靶基因。實時熒光定量PCR檢測三組細胞miRNA-101的表達以及候選靶基因mTOR在骨肉瘤細胞空白對照組、模擬物陰性對照組以及miRNA-101模擬物轉(zhuǎn)染組中的m

10、RNA表達。Western Blot檢測以上三組骨肉瘤細胞mTOR的蛋白表達，同時應用Western Blot檢測三組細胞即空白組、轉(zhuǎn)染mTOR小干擾RNA（mTOR-siRNA）組以及轉(zhuǎn)染mTOR-siRNA陰性對照組）的mTOR蛋白表達。
　　結(jié)果：靶點分析軟件初步推定mTOR為miRNA-101的候選靶基因之一。而熒光素酶報告基因也證實了此推定的正確性，在熒光素酶報告基因檢測中，共轉(zhuǎn)染miRNA-101模擬物和pGL3-3'

11、-mTOR-Wt組與共轉(zhuǎn)染陰性對照物和pGL3-3'-UTR-mTOR-Mut組相比，前組的熒光強度明顯降低，較后者減低了0.46，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。MTOR的mRNA表達量在miRNA-101模擬物組較其它兩組顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Western Blot檢測表明，miRNA-101模擬物組mTOR蛋白的表達較其余兩組減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。且mTOR-siRNA轉(zhuǎn)染組mTOR的蛋

12、白表達最少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：mTOR為miRNA-101的候選靶基因之一，miRNA-101可同時抑制mTOR的mRNA及蛋白表達。MiRNA-101調(diào)控骨肉瘤細胞生物學特性的改變可能是通過調(diào)節(jié)mTOR通路關(guān)鍵分子mTOR而發(fā)揮作用。
　　第四部分 MicroRNA-101調(diào)控哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTOR對骨肉瘤細胞增殖和凋亡影響實驗研究
　　目的：探討miRNA-101是否通過調(diào)控哺乳

13、動物雷帕霉素靶蛋白mTOR而影響人骨肉瘤細胞的增值和凋亡。
　　方法：以人骨肉瘤細胞系Saos-2細胞為研究對象，實驗設計為如下幾部分：⑴細胞轉(zhuǎn)染后分成三組分別為空白對照組、模擬物miRNA-101陰性對照組以及miRNA-101模擬物轉(zhuǎn)染組。⑵細胞轉(zhuǎn)染后分成三組分別為空白對照組、mTOR-siRNA陰性對照組以及mTOR-siRNA轉(zhuǎn)染組。⑶細胞轉(zhuǎn)染后分成兩組分別為模擬物
　　miRNA-101+mTOR-siRNA陰性對

14、照共轉(zhuǎn)染組和mTOR-siRNA陰性對照轉(zhuǎn)染組。⑷細胞轉(zhuǎn)染后分成兩組分別為模擬物miRNA-101+mTOR-siRNA共轉(zhuǎn)染組和mTOR-siRNA轉(zhuǎn)染組。采用MTT法檢測不同時間點以上各組骨肉瘤細胞的增殖，流式細胞儀檢測以上各組骨肉瘤細胞的凋亡變化。
　　結(jié)果：在miRNA-101模擬物轉(zhuǎn)染組、模擬物miRNA-101+mTOR-siRNA陰性對照共轉(zhuǎn)染組和mTOR-siRNA轉(zhuǎn)染組，人骨肉瘤細胞的增殖均受到明顯抑制，而細胞凋