靶向沉默RIPK4基因?qū)侨饬鯩G-63細(xì)胞生物學(xué)特性的研究.pdf

1、目的：研究RIPK4（Receptor-interacting-protein kinase4）基因在骨肉瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)；通過小干擾RNA沉默骨肉瘤MG-63細(xì)胞中RIPK4基因的表達(dá)，觀察抑制RIPK4基因后對骨肉瘤MG-63細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　方法：使用免疫組織化學(xué)方法和實(shí)時熒光定量PCR法分別檢測骨肉瘤患者原發(fā)灶中RIPK4蛋白的表達(dá)情況及骨肉瘤細(xì)胞中RIPK4mRNA的表達(dá)情況；設(shè)計具有沉默效應(yīng)作用的RIPK

2、4siRNA，將其通過載體脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入骨肉瘤細(xì)胞，使MG-63細(xì)胞中RIPK4基因的表達(dá)水平下調(diào)，CCK-8法檢測骨肉瘤細(xì)胞的增殖水平；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的情況；實(shí)時熒光定量 PCR法和蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）法分別從mRNA及蛋白的表達(dá)水平檢測MG-63骨肉瘤細(xì)胞中β連環(huán)蛋白（β-catenin），細(xì)胞周期蛋白（CyclinD1），細(xì)胞凋亡及自噬相關(guān)因子Bcl-2、LC3及Beclin1的表達(dá)。
　　結(jié)果：

3、免疫組織化學(xué)方法檢測顯示骨肉瘤患者標(biāo)本中RIPK4蛋白表達(dá)陽性，實(shí)時熒光定量PCR法結(jié)果顯示RIPK4mRNA在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于正常成骨細(xì)胞（P＜0.05）；干擾后，RIPK4siRNA轉(zhuǎn)染組骨肉瘤MG-63細(xì)胞中RIPK4 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平及蛋白的表達(dá)水平明顯低于陰性對照組（control siRNA組）及空白對照組（未加任何試劑的MG-63細(xì)胞）（p＜0.05）；CCK-8檢測骨肉瘤MG-63細(xì)胞 RIPK4siRNA轉(zhuǎn)

4、染組較陰性對照組及空白對照組增殖能力明顯受到抑制（p＜0.05）；RIPK4siRNA轉(zhuǎn)染組骨肉瘤MG-63細(xì)胞中β-catenin mRNA及CyclinD1 mRNA及其蛋白的表達(dá)水平下調(diào)（p＜0.05）；流式細(xì)胞儀檢測骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染組較 control siRNA組及空白對照組細(xì)胞凋亡率明顯增加（p＜0.05）；RIPK4siRNA轉(zhuǎn)染組骨肉瘤MG-63細(xì)胞中Bcl-2 mRNA及其蛋白表達(dá)量下降（p＜0.05），Beclin1及