FOXJ1在胃癌惡性生物學(xué)表型中的作用和機(jī)制.pdf

1、【背景】
　　胃癌是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤,發(fā)病率和死亡率居高不下。胃癌的發(fā)生受多因素影響,其發(fā)病機(jī)制尚有待闡明。盡管早期診斷和新型治療方法不斷出現(xiàn),但是進(jìn)展期胃癌因生長(zhǎng)迅速和高轉(zhuǎn)移率,預(yù)后差,5年生存率低于20％。而目前臨床上主要通過(guò)TNM分期、腫瘤組織學(xué)類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征對(duì)胃癌患者進(jìn)行術(shù)前評(píng)估和預(yù)后判斷的方式敏感性較低,且存在爭(zhēng)議。因此,分析胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制,尋找新的胃癌早期診斷分子生物學(xué)指標(biāo)和潛在治療靶

2、點(diǎn),對(duì)改善胃癌預(yù)后和提高患者生存率具有重要意義。
　　FOX轉(zhuǎn)錄因子家族是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類新的參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要分子。FOX家族成員在胃癌中發(fā)揮的作用也吸引了眾多研究者。已有研究發(fā)現(xiàn),一方面,FOXC2、FOXM1和FOXQ1在胃癌中表達(dá)增高,FOXM1b可以促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的活化和誘導(dǎo)胃癌血管的生成,提示其在胃癌中可能發(fā)揮促癌作用。另一方面,FOXD3在幽門螺桿菌感染誘導(dǎo)的超甲基化過(guò)程中下調(diào),參與HP感染引發(fā)的胃癌;FO

3、XO3a與RUNX3協(xié)同活化Bim,共同誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡,提示FOXD3和FOXO3a可能參與抑制胃癌的發(fā)生。而其他FOX家族成員在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用仍不清楚。我們實(shí)驗(yàn)組主要研究 FOX家族在胃腸道腫瘤和肝癌中的作用,并已發(fā)現(xiàn),FOXM1和FOXC1可通過(guò)促進(jìn)MMP-7、RhoC和ROCK1的表達(dá)或誘導(dǎo)EMT促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移;FOXQ1可通過(guò)誘導(dǎo)EMT和募集巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)發(fā)揮促癌作用并促進(jìn)轉(zhuǎn)移發(fā)生。
　　FOXJ1作為FOX家族的成員

4、之一,除了在胚胎發(fā)育和分化、纖毛形成、抑制自身免疫反應(yīng)等生物學(xué)行為中起著重要的調(diào)控作用之外,近年來(lái)也發(fā)現(xiàn)FOXJ1在不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著不同的作用:一方面,FOXJ1在乳腺癌和卵巢癌中可能發(fā)揮抑癌作用;另一方面,也有研究報(bào)道FOXJ1在肝癌中可能發(fā)揮促癌作用。提示我們,FOXJ1在腫瘤中可能呈異質(zhì)性表達(dá),并在不同的腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮不同作用。而FOXJ1在胃癌中的表達(dá)情況、作用機(jī)制和臨床價(jià)值仍無(wú)研究報(bào)道。
　　【目的】

5、　　檢測(cè)FOXJ1在胃癌組織中的表達(dá)變化情況,分析其表達(dá)水平與臨床病理學(xué)特征以及患者預(yù)后之間的關(guān)系,探討其潛在的臨床價(jià)值;觀察FOXJ1對(duì)胃癌惡性生物學(xué)表型尤其是轉(zhuǎn)移表型的影響;探討FOXJ1抑制胃癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。為闡明FOXJ1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制,以及FOXJ1在胃癌診斷和治療中的潛在價(jià)值奠定理論基礎(chǔ)。
　　【方法】
　　1、收集105例胃癌及其相匹配的癌旁組織石蠟標(biāo)本,定制組織芯片,利用免疫組化染色檢測(cè)FOX

6、J1在胃癌組織和相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況;收集7例手術(shù)切除新鮮冰凍胃癌及癌旁組織標(biāo)本,利用Real-time PCR和Western blot從mRNA水平和蛋白水平驗(yàn)證免疫組化結(jié)果;
　　2、根據(jù)免疫組化染色評(píng)分結(jié)果,統(tǒng)計(jì)分析FOXJ1表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理學(xué)特征之間的相關(guān)性;收集105例胃癌患者的隨訪資料,采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,應(yīng)用log-rank檢驗(yàn)分析FOXJ1的表達(dá)與胃癌患者生存時(shí)間之間的關(guān)系;

7、應(yīng)用單因素和多因素COX回歸模型分析影響胃癌患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素;
　　3、購(gòu)買40例胃癌與配對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶芯片,利用免疫組化染色對(duì)比分析FOXJ1在發(fā)生轉(zhuǎn)移的胃癌原發(fā)灶和相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)水平;
　　4、利用Western blot檢測(cè)FOXJ1在各胃癌細(xì)胞系和永生化胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1中的表達(dá)情況;根據(jù)檢測(cè)結(jié)果,選取胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、BGC823和永生化胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1,以及高/低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)胞系

8、MKN28M/MKN28NM和
　　SGC7901M/SGC7901NM作為后續(xù)研究的細(xì)胞模型,利用成功包裝的FOXJ1過(guò)表達(dá)慢病毒載體(LV-FOXJ1)和相應(yīng)的對(duì)照載體(LV-control),分別感染AGS、BGC823、MKN28M和SGC7901M細(xì)胞,利用FOXJ1shRNA慢病毒載體(LV-FOXJ1-shRNA)和相應(yīng)的對(duì)照載體(LV-shRNA-control),分別感染GES-1、MKN28NM和SGC7901

9、NM細(xì)胞,經(jīng)嘌呤霉素抗性篩選獲得穩(wěn)定感染細(xì)胞株AGS-FOXJ1、BGC823-FOXJ1、MKN28M-FOXJ1、SGC7901M-FOXJ1、GES-shFOXJ1、MKN28NM-shFOXJ1、SGC7901NM-shFOXJ1,并利用Real-time PCR和Western blot分別驗(yàn)證感染的有效性;
　　5、利用MTT實(shí)驗(yàn)觀察改變FOXJ1的表達(dá)對(duì)AGS、BGC823和GES-1細(xì)胞體外增殖能力的影響;

10、　　6、利用裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)觀察改變FOXJ1的表達(dá)對(duì)BGC823和GES-1細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響;
　　7、利用Array Scan VTI1700 plus高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)研究FOXJ1對(duì)胃癌細(xì)胞的體外運(yùn)動(dòng)、遷移和侵襲能力的影響;
　　8、利用裸鼠尾靜脈注射內(nèi)臟轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),結(jié)合活體成像技術(shù),研究FOXJ1對(duì)高/低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)胞系MKN28M/MKN28NM體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響

11、;
　　9、利用Real-time PCR和Western blot從mRNA水平和蛋白水平分別檢測(cè)FOXJ1對(duì)高/低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)胞系MKN28M/MKN28NM中MMP-2和MMP-9及其內(nèi)源特異性活性調(diào)節(jié)因子TIMP2和TIMP1表達(dá)的影響;
　　10、利用免疫組化染色檢測(cè)FOXJ1與β-catenin在胃癌組織中的表達(dá)相關(guān)性;
　　11、利用免疫熒光染色,檢測(cè)過(guò)表達(dá)或干擾FOXJ1表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞亞系MKN2

12、8M-FOXJ1、MKN28NM-shFOXJ1中β-catenin表達(dá)部位的變化;
　　12、利用Western blot檢測(cè)FOXJ1對(duì)高/低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)胞系MKN28M/MKN28NM中β-catenin和磷酸化β-catenin表達(dá)的影響。
　　【結(jié)果】
　　1、FOXJ1在胃癌組織中的表達(dá)明顯低于相應(yīng)的癌旁組織
　　免疫組化染色結(jié)果顯示,FOXJ1在癌旁組織中主要定位于胞核,胞漿中也有表達(dá),而在胃癌組

13、織中FOXJ1主要定位于胞漿,且表達(dá)強(qiáng)度明顯減弱。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),FOXJ1在105例癌旁組織中有99例表達(dá)呈陽(yáng)性,表達(dá)陽(yáng)性率為94.3%,而在105例胃癌組織中僅有51例表達(dá)呈陽(yáng)性,表達(dá)陽(yáng)性率為48.6%。FOXJ1在胃癌組織中的表達(dá)明顯低于相應(yīng)的癌旁組織,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。利用Real time PCR和Western blot檢測(cè)FOXJ1在7例新鮮胃癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)情況,結(jié)果表明:7例胃癌組織中

14、,有6例FOXJ1的表達(dá)明顯低于相應(yīng)癌旁組織,與免疫組化結(jié)果一致。
　　2、FOXJ1的表達(dá)水平與胃癌分期和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)
　　根據(jù)免疫組化評(píng)分結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析提示,FOXJ1的表達(dá)水平與胃癌的浸潤(rùn)深度(P<0.001)、TNM分期(P=0.039)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.003)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.029)密切相關(guān),即TNM分期越高、浸潤(rùn)深度越深、出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌病例,FOXJ1的表達(dá)越低。
　　3、FOXJ1

15、的表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后密切相關(guān),并可作為胃癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素
　　Log-rank生存分析結(jié)果提示,與FOXJ1陽(yáng)性患者相比,FOXJ1陰性患者的生存時(shí)間明顯縮短(P=0.037);單因素和多因素COX回歸模型分析提示FOXJ1表達(dá)水平與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移可作為影響胃癌患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素。
　　4、FOXJ1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)水平明顯低于胃癌原發(fā)灶
　　免疫組化結(jié)果顯示,在40例胃癌原發(fā)灶中,

16、FOXJ1主要在胞漿中呈中等強(qiáng)度或弱表達(dá),而在相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中僅呈現(xiàn)非特異弱表達(dá);同時(shí)FOXJ1陰性表達(dá)的患者多傾向于出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,FOXJ1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)明顯低于相應(yīng)的胃癌原發(fā)灶(P=0.005)。
　　5、FOXJ1在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)下調(diào)
　　FOXJ1在胃癌細(xì)胞系MKN28、MKN45、SGC7901、AGS、BGC823中的表達(dá)水平明顯低于永生化胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1,而FOXJ1在高轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)

17、胞系MKN28M、SGC7901M和GC9811P中的表達(dá)也明顯低于相應(yīng)的低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)胞系MKN28NM、SGC7901NM和GC9811。
　　6、FOXJ1可抑制胃癌細(xì)胞的體內(nèi)外增殖能力
　　MTT結(jié)果顯示,上調(diào)FOXJ1的表達(dá)可降低AGS和BGC823細(xì)胞的體外增殖能力,而下調(diào)FOXJ1的表達(dá)可以增強(qiáng)GES-1細(xì)胞的體外增殖能力;裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)顯示,過(guò)表達(dá)FOXJ1可抑制BGC823細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力,而干擾FO

18、XJ1的表達(dá)可促進(jìn)GES-1細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力。
　　7、FOXJ1可抑制胃癌細(xì)胞的體外運(yùn)動(dòng)、遷移和侵襲能力以及體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力高內(nèi)涵分析結(jié)果顯示,上調(diào)FOXJ1的表達(dá)可減弱高轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)胞系的體外運(yùn)動(dòng)能力,而下調(diào)FOXJ1的表達(dá)則增強(qiáng)低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)胞系的體外運(yùn)動(dòng)能力;劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,上調(diào)FOXJ1的表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲,而下調(diào)FOXJ1的表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲;裸鼠尾靜脈注

19、射內(nèi)臟轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)合活體成像分析結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)FOXJ1的MKN28M-FOXJ1細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)形成轉(zhuǎn)移的光學(xué)信號(hào)強(qiáng)度明顯減弱,且在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移率降低,肝臟表面形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)減少,而下調(diào)表達(dá)FOXJ1的MKN28NM-shFOXJ1細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)形成轉(zhuǎn)移的光學(xué)信號(hào)強(qiáng)度顯著增強(qiáng),且在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移率升高,肝臟表面形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)增加。
　　8、FOXJ1可抑制胃癌細(xì)胞系中MMP2和MMP9的表達(dá),并促進(jìn)胃癌細(xì)胞系中TIMP1、TIM

20、P2的表達(dá)
　　Real time PCR和Western blot結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)FOXJ1可以顯著降低高轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)胞系MKN28M中MMP2、MMP9的表達(dá),并增強(qiáng)TIMP1、TIMP2的表達(dá),而干擾FOXJ1的表達(dá)可明顯增加低轉(zhuǎn)移潛能胃癌細(xì)胞系MKN28NM中MMP2、MMP9的表達(dá),并降低TIMP1、TIMP2的表達(dá)。
　　9、FOXJ1可能通過(guò)Wnt/β-catenin通路發(fā)揮作用
　　免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn),

21、在105例胃癌組織中,有50例胃癌組織呈β-catenin核表達(dá)陽(yáng)性,與FOXJ1共定位統(tǒng)計(jì)分析提示,FOXJ1與β-catenin核表達(dá)在胃癌組織中呈負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)為-0.228,P=0.003);免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),下調(diào)FOXJ1可使MKN28NM細(xì)胞中β-catenin在細(xì)胞漿中聚集,并在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)β-catenin表達(dá);而上調(diào)FOXJ1可減少M(fèi)KN28M細(xì)胞胞漿中β-catenin的聚集,并抑制β-catenin發(fā)生核轉(zhuǎn)位

22、;Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,FOXJ1對(duì)各亞系細(xì)胞內(nèi)總β-catenin的影響不大,但是下調(diào)FOXJ1可降低MKN28NM細(xì)胞中β-catenin的磷酸化水平,而上調(diào)FOXJ1可增強(qiáng)MKN28M細(xì)胞中β-catenin的磷酸化水平。
　　【結(jié)論】
　　1、FOXJ1在胃癌組織中表達(dá)減弱,且FOXJ1在胃癌中的下調(diào)與腫瘤浸潤(rùn)深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān);FOXJ1的表達(dá)水平與胃癌患者生存時(shí)間呈正相

23、關(guān),并可作為影響胃癌患者生存的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。提示FOXJ1有望作為臨床診斷胃癌的新的分子標(biāo)志物和治療靶向。
　　2、FOXJ1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)減弱,且FOXJ1陰性表達(dá)的患者多傾向于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí),FOXJ1參與抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等多種惡性生物學(xué)行為。
　　3、FOXJ1可能通過(guò)增強(qiáng)TIMP1、TIMP2的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞中MMP9和MMP2的活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)降解；通過(guò)抑制β-cateni