櫛孔扇貝(Chlamys farreri)性類固醇激素和17β-羥類固醇脫氫酶8在性腺發(fā)育過程中的潛在作用.pdf

1、研究表明性類固醇激素廣泛地存在于軟體動物中,并在軟體動物生殖過程中發(fā)揮著潛在的重要作用,但是目前對軟體動物內(nèi)分泌系統(tǒng)的了解還十分有限,而且在軟體動物性類固醇激素的來源和功能機制等問題上還存有爭議。
　　櫛孔扇貝(Chlamys farreri)是一種雌雄異體、性別穩(wěn)定的雙殼貝類,是我國北方重要的經(jīng)濟物種。本研究以櫛孔扇貝為研究對象,首先檢測了櫛孔扇貝年生殖周期性腺中雌二醇和睪酮的含量逐月變化,探討了性類固醇激素在櫛孔扇貝生殖過程中

2、的潛在作用;克隆并鑒定出了17β-羥類固醇脫氫酶8(17β-HSD8)基因,并對其序列特征和體外催化活性進行了分析;進一步,研究分析了17β-HSD8在櫛孔扇貝性腺和胚胎、幼蟲中的時空表達模式,并探討了其在性類固醇激素合成代謝途徑、配子發(fā)生和個體早期發(fā)育過程中的潛在作用。
　　為了探討性類固醇激素在櫛孔扇貝生殖過程中的潛在作用,本文通過酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)檢測并分析了2012年1月到12月期間櫛孔扇貝性腺中雌二醇和睪酮含

3、量的變化。根據(jù)配子發(fā)生和排放過程的組織學特征,我們將櫛孔扇貝性腺年生殖周期劃分為休止期、增殖期、生長期、成熟期、第一次排放期、恢復期和第二次排放期共七個時期。在櫛孔扇貝年生殖周期過程中,性腺中雌二醇含量變化范圍是75.07 pg/g~666.24 pg/g,而睪酮含量變化范圍是91.09 pg/g~506.28 pg/g。櫛孔扇貝卵巢中雌二醇的含量全年高于精巢雌二醇含量,而精巢中睪酮的含量在配子發(fā)生階段高于卵巢睪酮含量。卵巢中雌二醇的含

4、量和精巢中睪酮的含量均隨著配子發(fā)生而升高,在配子排放前達到最高值,并在配子排放后迅速下降。櫛孔扇貝卵巢中雌二醇含量和卵徑具有正相關(guān)性(r=0.743,P<0.05, n=25),表明雌二醇可能在卵子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。櫛孔扇貝性腺中性類固醇激素含量的變化及其與生殖過程的相互關(guān)系說明,性激素在性別維持、性腺分化、配子發(fā)生和排放等過程中均發(fā)揮著重要在潛的作用。
　　在脊椎動物中,17β-羥類固醇脫氫酶(17β-HSDs)是類固醇合

5、成和代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一。盡管研究表明性類固醇激素在軟體動物的生殖過程中具有重要作用,但是軟體動物中17β-HSDs的存在和功能研究還很少。本文在櫛孔扇貝中克隆并鑒定出了17β-HSD8基因,該基因cDNA全長1104 bp,具有759 bp的開放閱讀框(ORF),編碼252個氨基酸。系統(tǒng)進化分析表明,櫛孔扇貝17β-HSD8屬于短鏈脫氫酶超家族(SDR),并與其他動物中的17β-HSD8具有高度的同源性。本文使用原核表達系統(tǒng)在大腸桿

6、菌(E. coli)中表達出了櫛孔扇貝17β-HSD8重組蛋白,并通過復性獲得了可溶性的17β-HSD8蛋白。體外酶活性實驗揭示,復性的17β-HSD8以NAD+作為輔酶,可有效地催化雌二醇轉(zhuǎn)化為雌酮,并可較弱地催化睪酮轉(zhuǎn)化為雄烯二酮。
　　半定量RT-PCR結(jié)果顯示,17β-HSD8 mRNA在增殖期櫛孔扇貝各組織中均有表達,并在消化腺、腎臟和卵巢中表達量較高,在外套膜、肌肉、鰓和精巢中表達量較低。qRT-PCR和Western

7、 blot結(jié)果顯示:卵巢和精巢中17β-HSD8 mRNA和蛋白的表達量均隨著配子發(fā)生過程逐漸升高;在生長期和成熟期精巢中17β-HSD8的表達量顯著性地高于卵巢。原位雜交和免疫組化實驗結(jié)果顯示,櫛孔扇貝17β-HSD8 mRNA和蛋白在濾泡細胞和各期配子(除精子外)中均有表達;配子中陽性信號的強度隨著配子的發(fā)育逐漸降低。這些研究結(jié)果表明,櫛孔扇貝17β-HSD8參與調(diào)控配子發(fā)生過程;進一步分析發(fā)現(xiàn),這種調(diào)控作用可能是通過調(diào)節(jié)雌二醇水平

8、實現(xiàn)的。
　　對櫛孔扇貝胚胎和幼蟲中17β-HSD8 mRNA的時空表達模式研究結(jié)果顯示:櫛孔扇貝17β-HSD8在未受精卵中即有高水平的表達,顯示它是一個母源性表達的基因。在卵裂期胚胎中17β-HSD8的表達量顯著下降,但是囊胚中其表達量顯著提高,暗示17β-HSD8合子基因在此時期開始表達。在隨后的胚胎和幼蟲發(fā)育過程中17β-HSD8的表達量呈波動性變化。原位雜交結(jié)果顯示,17β-HSD8 mRNA陽性信號在各發(fā)育階段胚胎中均

9、勻分布,推測17β-HSD8可能通過調(diào)節(jié)性類固醇激素水平參與櫛孔扇貝早期發(fā)育的調(diào)控。此外,在D形幼蟲中17β-HSD8 mRNA高水平表達,并且內(nèi)臟團附近17β-HSD8陽性信號強度較高,表明17β-HSD8可能也參與起始器官發(fā)生。
　　綜上,櫛孔扇貝雌二醇和睪酮在性別維持、性腺分化、配子發(fā)生和排放等生理過程中具有潛在的重要作用;17β-HSD8通過調(diào)節(jié)性腺中類固醇激素含量參與調(diào)控配子發(fā)生過程,并且可能與胚胎發(fā)育和幼蟲器官發(fā)生過程