櫛孔扇貝(Chlamys farreri)三個(gè)性腺發(fā)育相關(guān)基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、性腺發(fā)育是發(fā)育生物學(xué)研究的重要領(lǐng)域之一，這是一個(gè)多基因參與調(diào)控的過程，并且受到性激素和環(huán)境等因素的影響。當(dāng)前人們對于性激素在性腺發(fā)育過程中的作用已經(jīng)有了很好的認(rèn)知，然而，有關(guān)性激素活化和滅活的相關(guān)分子基礎(chǔ)和機(jī)制僅在哺乳動(dòng)物進(jìn)行了系統(tǒng)的闡述。貝類是動(dòng)物界中的重要類群，然而其在性激素合成和降解領(lǐng)域的研究卻相當(dāng)?shù)夭蛔?，一定程度地限制了人們對其性腺發(fā)育和調(diào)控的理解。本研究以櫛孔扇貝（Chlamys farreri）參與雌二醇、5α-雄烯二醇和5

2、α-雄烷-3α，17β-二元醇等激素滅活的17β-HSD4和17β-HSD14為研究對象，從櫛孔扇貝轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出與其它物種17β-HSD4和17β-HSD14高度同源的兩個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽，采用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE）克隆得到這兩個(gè)基因的全長cDNA序列，進(jìn)一步采用半定量和定量RT-PCR技術(shù)，檢測了目的基因在櫛孔扇貝各主要組織和不同發(fā)育時(shí)期性腺中的表達(dá)。結(jié)果如下：
　　櫛孔扇貝17β-HSD4 cDNA全長為24

3、17 bp，開放閱讀框?yàn)?223 bp，編碼740個(gè)氨基酸，推導(dǎo)的氨基酸序列含有SDR超家族的4個(gè)保守區(qū)和17β-HSD4的3個(gè)酶結(jié)構(gòu)域，且與人等脊椎動(dòng)物的序列相似性均在58％以上。半定量RT-PCR顯示該基因在櫛孔扇貝精巢、卵巢、肌肉、外套膜、鰓、肝胰腺和腎臟等各組織中均有表達(dá)，其中在肝胰腺和腎臟中的表達(dá)量明顯高于其他組織，暗示櫛孔扇貝多種組織中均可以合成17β-HSD4。定量RT-PCR結(jié)果顯示，該基因在性腺不同發(fā)育時(shí)期的精、卵巢中

4、表達(dá)模式不同；并且在生長期和成熟期的精巢中表達(dá)量顯著性高于同時(shí)期的卵巢（P＜0.05）；暗示該基因?qū)笨咨蓉惥舶l(fā)育和成熟的作用較卵巢更顯著，推測該基因可能通過β-氧化調(diào)節(jié)脂類物質(zhì)的積累，從而影響性腺發(fā)育。
　　櫛孔扇貝17β-HSD14 cDNA全長為1154 bp，開放閱讀框?yàn)?19 bp，可編碼272個(gè)氨基酸。該氨基酸序列不僅含有SDR超家族的4個(gè)保守區(qū)，還含有與17β-HSD14/NADP/estradiol三元復(fù)合物結(jié)構(gòu)

5、相對應(yīng)的Lys158-Tyr154-Ser141三聯(lián)體殘基，且氨基酸全序列與其他物種的17β-HSD14相似性均在50％以上。定量RT-PCR結(jié)果顯示，該基因在不同發(fā)育時(shí)期精、卵巢中表達(dá)的特征與17β-HSD4的類似，即在生長期和成熟期精巢中的表達(dá)量也顯著性高于同時(shí)期的卵巢（P＜0.05），并且在成熟期精巢的表達(dá)量明顯高于其他各時(shí)期。推測櫛孔扇貝17β-HSD14可能具有羥基類固醇脫氫酶的活性，并參與雌二醇水平的調(diào)節(jié)。
　　進(jìn)一步

6、，我們從櫛孔扇貝精、卵巢差異表達(dá)譜中篩選出10個(gè)兩性差異表達(dá)的Tag片段，通過半定量RT-PCR驗(yàn)證，篩選出2個(gè)卵巢特異表達(dá)的Tag，4個(gè)卵巢高表達(dá)的Tag和1個(gè)精巢高表達(dá)的Tag；以其中1個(gè)卵巢中特異表達(dá)的Tag（>FTYGYVA03G8KDR）序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)RACE引物，并擴(kuò)增獲得一個(gè)3'末端含有22 bp連續(xù)poly（A）的長為1142 bp的cDNA序列片段，GenBank數(shù)據(jù)庫比對尚未搜索到同源序列。鑒于其在除卵巢外的櫛孔扇