櫛孔扇貝(Chlamys farreri)酚氧化酶的分離純化及特性研究.pdf

1、前期研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌多糖刺激和病毒感染均可導(dǎo)致櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)血細(xì)胞中酚氧化酶活力急劇升高，表明酚氧化酶是櫛孔扇貝免疫應(yīng)答系統(tǒng)中最為敏感高效的因子之一(Xing et al.，2008；Lin et al.，2011)。本論文從櫛孔扇貝血細(xì)胞中分離純化出酚氧化酶，分析了該酶的生化及酶學(xué)特性；研究了酚氧化酶體外氧化產(chǎn)物的抗菌活性；分析比較了櫛孔扇貝酚氧化酶與海灣扇貝(Argopecten irradians)、菲律賓

2、蛤仔(Ruditapes philippinarum)、皺紋盤(pán)鮑(Haliotis discus hannai)、毛蚶(Scapharca subcrenata)酚氧化酶在生化及酶學(xué)特性上的差異，為櫛孔扇貝酚氧化酶免疫機(jī)制的研究積累了數(shù)據(jù)。
　　 (1)櫛孔扇貝酚氧化酶的分離純化及生化和酶學(xué)特性研究。采用線(xiàn)性連續(xù)梯度非變性電泳(native-PAGE)結(jié)合凝膠過(guò)濾層析的方法從櫛孔扇貝血細(xì)胞中分離純化出酚氧化酶，研究了該酶的底物特

3、異性、動(dòng)力學(xué)參數(shù)以及溫度、pH、二價(jià)金屬離子和抑制劑對(duì)酶活的影響。結(jié)果顯示：提純的酚氧化酶在native-PAGE中分子量為576kDa，SDS-PAGE中分子量為53kDa，表明該酶是由一種亞基組成的寡聚體；酚氧化酶對(duì)L-DOPA、鄰苯二酚、多巴胺和對(duì)苯二酚的米氏常數(shù)Km分別為0.61mmol/L、0.20mmol/L、0.88mmol/L和0.83mmol/L，表明該酶是一種漆酶型的酚氧化酶，其對(duì)鄰苯二酚的親和力最高，對(duì)多巴胺的親和

4、力最低，對(duì)L-DOPA的親和力高于對(duì)苯二酚；酚氧化酶在30℃和pH8.0時(shí)具有最高酶活力；酚氧化酶活力受到Ca2+和Mg2+的強(qiáng)烈激活，但受到Fe2+的顯著抑制；酚氧化酶活力不受硫代尿素和疊氮鈉的影響，但受到抗壞血酸、亞硫酸鈉、檸檬酸、半胱氨酸、二乙基二硫代氨基甲酸鈉(DETC)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)的強(qiáng)烈抑制，表明該酶是一種含銅的金屬酶。
　　 (2)櫛孔扇貝酚氧化酶體外氧化產(chǎn)物的抗菌活性研究。通過(guò)觀察和測(cè)定提純的櫛孔

5、扇貝酚氧化酶與底物處理后的細(xì)菌生長(zhǎng)情況，研究了櫛孔扇貝酚氧化酶體外氧化產(chǎn)物對(duì)溶藻膠弧菌Vibrio alginolyticus、副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus、殺鮭氣單胞菌Aeromonas salmonicida、愛(ài)德華氏菌Edwardsiellatarda、停乳鏈球菌Streptococcus dysgadysgalactiae、海豚鏈球菌Streptococcus iniae和溶壁微球菌Micrococcu

6、s lysodeikticus的抗菌活性。細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定結(jié)果顯示：酚氧化酶自身不能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，酚氧化酶與L-DOPA或多巴胺的混合物可抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，表明是酚氧化酶的氧化產(chǎn)物而不是酚氧化酶具有抗菌活性；使用L-DOPA作底物時(shí)，酚氧化酶氧化產(chǎn)物僅對(duì)殺鮭氣單胞菌顯示出明顯的抑制作用，而使用多巴胺作為底物時(shí)，酚氧化酶氧化產(chǎn)物對(duì)革蘭氏陰性的溶藻膠弧菌、副溶血弧菌和殺鮭氣單胞菌均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制作用，表明以多巴胺為底物獲得的酚氧化酶氧化產(chǎn)物比

7、以L(fǎng)-DOPA為底物獲得的氧化產(chǎn)物具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒性；酚氧化酶的體外氧化產(chǎn)物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性的停乳鏈球菌、海豚鏈球菌和溶壁微球菌無(wú)抑制作用，表明與鏈球菌和微球菌相比，櫛孔扇貝酚氧化酶氧化產(chǎn)物對(duì)弧菌和氣單胞菌細(xì)胞成分的毒性作用更大；酚氧化酶氧化產(chǎn)物對(duì)同為革蘭氏陰性的愛(ài)德華氏菌無(wú)抑制作用，分析原因可能是愛(ài)德華氏菌分泌的胞外產(chǎn)物中含有一些具有抗氧化活力的多糖，這些多糖抑制了酚氧化酶的氧化反應(yīng)。顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示：經(jīng)過(guò)與櫛孔扇貝酚氧化酶和多巴胺的共

8、孵育后，溶藻膠弧菌、副溶血弧菌和殺鮭氣單胞菌的菌體透明度降低，多數(shù)菌體喪失了運(yùn)動(dòng)能力，細(xì)菌聚集成團(tuán)，被黑色素所覆蓋。
　　 (3)櫛孔扇貝酚氧化酶與海灣扇貝、菲律賓蛤仔、皺紋盤(pán)鮑、毛蚶酚氧化酶的生化及酶學(xué)特性比較研究。采用線(xiàn)性連續(xù)梯度非變性電泳結(jié)合鄰苯二酚發(fā)色方法從海灣扇貝、菲律賓蛤仔、皺紋盤(pán)鮑、毛蚶的血細(xì)胞中分離出酚氧化酶，分析比較了櫛孔扇貝酚氧化酶與海灣扇貝、菲律賓蛤仔、皺紋盤(pán)鮑、毛蚶酚氧化酶在底物特異性、動(dòng)力學(xué)參數(shù)以及金屬

9、離子和抑制劑對(duì)酶活的影響上的差異。結(jié)果顯示：在檢測(cè)到的酚氧化酶種類(lèi)上，櫛孔扇貝與海灣扇貝、菲律賓蛤仔、皺紋盤(pán)鮑相同，在血細(xì)胞中僅檢測(cè)到一種酚氧化酶，而從毛蚶的血細(xì)胞中則檢測(cè)出4種酚氧化酶；在分子量上，櫛孔扇貝酚氧化酶(576kDa)與海灣扇貝(555kDa)和菲律賓蛤仔(563kDa)中的酚氧化酶較為接近，而與皺紋盤(pán)鮑(228kDa)和毛蚶(391kDa、206kDa、174kDa、未知分子量，分別命名為S391PO、S206PO、S1

10、74PO和SuPO)中的酚氧化酶差異較大；在底物特異性上，櫛孔扇貝酚氧化酶與海灣扇貝、菲律賓蛤仔、皺紋盤(pán)鮑和毛蚶中的酚氧化酶相似，均可以氧化鄰二酚類(lèi)底物和對(duì)二酚類(lèi)底物，為漆酶型的酚氧化酶；在動(dòng)力學(xué)參數(shù)上，櫛孔扇貝酚氧化酶對(duì)鄰苯二酚、L-DOPA、對(duì)苯二酚、多巴胺4種底物的Km值與海灣扇貝酚氧化酶比較接近，表明這兩種酶在催化能力上相近；在二價(jià)金屬離子對(duì)酶活的影響上，櫛孔扇貝與其他4種貝類(lèi)的酚氧化酶的活力均對(duì)二價(jià)金屬離子極為敏感，都受到Fe

11、2+的顯著抑制，但Ca2+和Mg2+都介導(dǎo)的酚氧化酶活力增強(qiáng)現(xiàn)象只在櫛孔扇貝和海灣扇貝中存在，綜合比較得出，櫛孔扇貝酚氧化酶的二價(jià)金屬離子影響結(jié)果與海灣扇貝酚氧化酶較為接近，表明這兩種酚氧化酶在蛋白結(jié)構(gòu)上可能具有很高的相似性；在抑制劑對(duì)酶活的影響上，櫛孔扇貝酚氧化酶與海灣扇貝、菲律賓蛤仔、皺紋盤(pán)鮑和毛蚶中的酚氧化酶都受到EDTA和DETC的強(qiáng)烈抑制，均為含銅的金屬酶，但櫛孔扇貝酚氧化酶與海灣扇貝酚氧化酶以及毛蚶中的S206PO和SuPO