人工催產(chǎn)花鰻鱺(Anguilla marmorata)卵巢發(fā)育過程中性類固醇激素含量影響.pdf

1、鰻鱺作為廣泛分布的降海洄游類魚類，其肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，因而被大多數(shù)國(guó)家所喜愛，像日本就以喜食河鰻而聞名；但在目前關(guān)于鰻鱺的繁殖育種仍有很多未解之謎，本研究主要集中在鰻鱺（花鰻鱺和日本鰻鱺）人工繁殖過程中血液和性腺內(nèi)類固醇激素的含量以及其變化。
　　性類固醇激素是動(dòng)物體內(nèi)性腺生長(zhǎng)發(fā)育的必要激素，尤其對(duì)于硬骨魚類人工繁殖過程中，睪酮(T)、孕酮(P)、雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、17α,20β-二羥基-4-孕烯

2、-3-酮(DHP)、17α-羥基孕酮(17α-OHP)在性腺的發(fā)育前期、發(fā)育中期以及發(fā)育末期對(duì)卵細(xì)胞的卵黃形成以及胚泡破裂有重要作用。
　　對(duì)池塘養(yǎng)殖的花鰻鱺多次注射鯉魚腦垂體（carp pituitary extract，20mg/kg·周）和人絨毛膜促性腺激素（hCG，300IU/kg·周）誘導(dǎo)花鰻鱺性腺發(fā)育以及成熟，采用貝克曼庫(kù)爾特免疫分析儀通過化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）研究此過程中，血清中游離類固醇類激素和糖蛋白類激素

3、的變化，分析比較了不同成熟時(shí)期花鰻鱺血清中三種類固醇激素，即睪酮、孕酮、17β-雌二醇和三種糖蛋白類激素，卵泡刺激素（FSH）、黃體生成激素（LH）、人絨毛膜促性腺激素（hCG），在發(fā)育前期（注射激素第2針后，即第二周）；發(fā)育中期（注射激素第9針后，即第九周）；發(fā)育中后期（注射激素第13針后，即第十三周）；發(fā)育后期（注射激素第16針后即，第十六周）；發(fā)育末期（注射激素第20針后，即第二十周）激素的含量和變化。結(jié)果表明，激素注射組的性腺逐

4、漸成熟，GSI顯著升高；而對(duì)照組GSI未見增長(zhǎng)，平均為(0.94±0.08)％；經(jīng)過16-19次注射，卵細(xì)胞到達(dá)核偏移階段，對(duì)此階段的花鰻鱺注射17α-羥基孕酮（17α-Hydroxyprogesterone），可成功誘導(dǎo)花鰻鱺性腺成熟與排卵。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中鰻魚血清中的17β-雌二醇（E2）不斷升高，尤其在性腺發(fā)育的中后期到后期階段，顯著升高；而孕酮（P）在發(fā)育后期升至最高，在發(fā)育后期至末期時(shí)顯著降低；睪酮（T）在發(fā)育后期出現(xiàn)最

5、高值。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組糖蛋白類激素--hCG在不同時(shí)期變化顯著，尤其在發(fā)育末期到達(dá)最高值,分析其原因可能與催產(chǎn)針的注射有關(guān)；FSH與LH含量變化與孕酮相似。此外，研究發(fā)現(xiàn)激素注射12h、24h、72h小周期內(nèi)，發(fā)育前期血清中孕酮的變化顯著，12h時(shí)最高而后降低；發(fā)育中期血清中E2變化顯著，注射激素24h時(shí)達(dá)到最高值。
　　性腺內(nèi)的類固醇激素則采用采用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC/MS/MS）方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，睪酮、孕酮、雌

6、二醇、雌三醇、17α，20β-二羥基-4-孕烯-3-酮、17α-羥基孕酮在xBridge C18色譜柱上得到良好分離，在0～200ng/ml的范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，檢測(cè)限為0.1～0.2ng/g，回收率超過了89％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差均小于7.3%；通過該方法表明，隨著外源激素注射次數(shù)的增加，花鰻鱺卵巢中6種類固類醇激素的含量整體呈逐步增加的趨勢(shì)，UPLC/MS/MS法能同時(shí)定量測(cè)定這6種性類固醇激素，具有靈敏、高回收率、穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)

7、。
　　河鰻人工繁殖采用鯉魚腦垂體注射法，在發(fā)育末期，對(duì)不同發(fā)育狀況（發(fā)育組、未發(fā)育組、難產(chǎn)組、自然產(chǎn)卵組）的雌性河鰻分析其性腺內(nèi)的類固醇激素含量（睪酮、孕酮、雌二醇、雌三醇、17α，20β-二羥基-4-孕烯-3-酮、17α-羥基孕酮）；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌二醇在未發(fā)育組中的檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組一樣，幾乎檢測(cè)不到；雌三醇的含量接近對(duì)照組，接近0.1ng/g；在難產(chǎn)組中DHP的含量顯著增高，超過40ng/g；因此，通過本研究發(fā)現(xiàn)雌激素可能與鰻魚

8、的性腺發(fā)育啟動(dòng)有關(guān)系，當(dāng)體內(nèi)的雌二醇的含量很低時(shí)，人工繁殖的河鰻無論注射多少外源激素，可能都不會(huì)引起相應(yīng)，分析其原因可能是形成雌激素的通路受阻；而DHP的含量過高可能會(huì)導(dǎo)致河鰻難產(chǎn)。
　　總之，本文集中研究了性類固醇激素在花鰻鱺發(fā)育不同時(shí)期的含量與變化，發(fā)現(xiàn)部分性類固醇激素是隨著發(fā)育階段的進(jìn)行其含量的顯著升高；對(duì)同一批河鰻的進(jìn)行采用相同的方法進(jìn)行人工繁殖，為何其效果差距如此大，主要原因是其性腺內(nèi)性類固醇激素在含量上有很大差距，分析