三子固本顆粒的制備及對(duì)糖尿腎病大鼠作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　糖尿病腎?。―iabetic nephropathy，DN）作為一種日益增加的世界范圍性的流行性疾病，是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，并且最終會(huì)導(dǎo)致終末期腎病(end-stage renaldisease，ESRD)。因此，深入研究糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制與治療，已經(jīng)成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。三子固本顆粒（Sanziguben Granule，SZBG）由金櫻子、余甘子、五味子、絞股藍(lán)等四味中藥組成，是臨床用于治療糖尿病腎病、

2、保護(hù)藥物腎損傷的經(jīng)驗(yàn)處方。因此，本文旨在三子固本顆粒的制備及其對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病大鼠保護(hù)作用機(jī)制的研究。
　　方法:
　　1、三子固本顆粒制備工藝研究
　　采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以總多糖含量和五味子醇甲含量作為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)化提取工藝;通過(guò)以吸濕性、溶解性和成型性作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)常用的輔料糊精、甘露醇、可溶性淀粉和乳糖四種輔料進(jìn)行篩選;通過(guò)比較顆粒的顏色均勻度和黏性大小，確定輔料的用量大小;通過(guò)以吸濕性、溶解性和成型性

3、作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定輔料糊精與甘露醇兩種輔料之間的用量比例。
　　2、三子固本顆粒指紋圖譜的研究
　　通過(guò)對(duì)流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)、流速三個(gè)因素進(jìn)行篩選確定色譜條件;運(yùn)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)進(jìn)行圖譜分析，建立三子固本顆粒HPLC指紋圖譜。
　　3、三子固本顆粒血清藥物化學(xué)的研究
　　采用血清藥物化學(xué)方法，結(jié)合UPLC/Q-TOF-MS/MS追蹤中藥復(fù)方三子固本顆粒的入血成分。雄性SD大鼠，灌胃給予三子固本顆粒溶

4、液（9.6g/kg）并記錄灌胃給藥時(shí)間。大鼠分別于灌胃給藥前和灌胃給藥后的0.5h、1h、2h和4h的五個(gè)時(shí)間點(diǎn)從大鼠眼眶后靜脈血管叢取血約500μL作為空白血樣和含藥血樣，室溫靜置，離心，分離血清。分別對(duì)空白血清和含藥血清進(jìn)行除蛋白、濃縮、復(fù)溶處理，于UPLC-Q-TOF-MS/MS進(jìn)樣分析。
　　4、三子固本顆粒有效成分含量的測(cè)定研究
　　通過(guò)紫外分光光度計(jì)法測(cè)定15批三子固本顆粒中總多糖的含量，通過(guò)HPLC法分別測(cè)定1

5、5批三子固本顆粒中沒(méi)食子酸和柯里拉京的含量;并對(duì)方法學(xué)的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率進(jìn)行考察。
　　5、三子固本顆粒對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病大鼠保護(hù)作用機(jī)制的研究
　　采用單側(cè)摘腎加腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)的方法復(fù)制實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病大鼠。用三子固本顆粒、福辛普利灌胃給藥大鼠，觀察三子固本顆粒對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病大鼠的一般情況的影響，并分別于藥物治療的2、4、6、8、10、12周末，測(cè)定大鼠的血糖和

6、24h尿蛋白。連續(xù)灌胃給藥12周后，收集大鼠血清、腎臟組織。通過(guò)測(cè)定大鼠血清肌酐(Scr)、尿素氮（BUN）作為指標(biāo)評(píng)價(jià)大鼠腎功能水平;通過(guò)測(cè)定大鼠甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)作為指標(biāo)評(píng)價(jià)大鼠血脂水平;通過(guò)測(cè)定大鼠血清丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)作為指標(biāo)評(píng)價(jià)大鼠氧化應(yīng)激水平。大鼠腎臟組織進(jìn)行HE染色、PAS染色和Masson染色觀察腎臟病理?yè)p傷;Western blotting檢測(cè)大鼠腎臟4-HNE、

7、Nrf2、HO-1、NQO1、Cleaved caspase-3、Bcl-2、E-cadherin、Vimentin以及α-SMA蛋白表達(dá)情況，研究三子固本顆粒保護(hù)實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病大鼠的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1、確定三子固本顆粒的制備工藝為:先按處方量分別稱取金櫻子、絞股藍(lán)、五味子和余甘子四種中藥材，用12倍量的水提取3次，每次1h，合并提取液，濾過(guò)，濾液減壓濃縮至相對(duì)密度為1.30左右的稠膏，然后加入2倍稠膏量的輔料

8、（糊精∶甘露醇=1∶1.5），制備軟材，過(guò)篩制成顆粒，干燥，整粒，分裝即得。
　　2、建立三子固本顆粒HPLC指紋圖譜，標(biāo)示了18個(gè)共有峰，并對(duì)其中4個(gè)共有峰進(jìn)行成分確認(rèn)，15批三子固本顆粒樣品的相似度均在0.93以上。
　　3、采用血清藥物化學(xué)方法，結(jié)合UPLC/Q-TOF-MS/MS追蹤中藥復(fù)方三子固本顆粒的入血成分分別是沒(méi)食子酸和柯里拉京。
　　4、紫外分光光度計(jì)法總多糖含量測(cè)定:線性范圍為1.9168μg/mL

9、-14.3760μg/mL(R2=0.9988)，平均回收率98.81％(RSD=2.7％，n=6)，15批樣品總多糖平均含量為112.8mg/g;HPLC法沒(méi)食子酸含量測(cè)定:線性范圍為4.94μg/mL-79.0μg/mL(R2=0.9996)，平均回收率97.87％(RSD=2.9％，n=6)，15批樣品沒(méi)食子酸平均含量為7.08mg/g;HPLC法柯里拉京含量測(cè)定:線性范圍為26.0μg/mL-459.0μg/mL(R2=0.99

10、99)，平均回收率98.94％(RSD=3.07％，n=6)，15批樣品柯里拉京平均含量為2.15mg/g。
　　5、給藥0至12周，與DN組比較，三子固本顆粒對(duì)于實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病大鼠的血糖并沒(méi)有明顯的降低作用，而對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病大鼠24h尿蛋白有明顯的降低作用。連續(xù)給藥12周后，實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病大鼠血脂和腎功能明顯得到改善，另三子固本顆粒通過(guò)降低血清中MDA水平、升高CAT、GSH活性，以提升機(jī)體的抗氧化能力，改善實(shí)驗(yàn)性DN大

11、鼠氧化性損傷。同時(shí)，三子固本顆粒通過(guò)上調(diào)Nrf2、HO-1、Bcl-2、E-cadherin蛋白表達(dá)，下調(diào)NQO1、Cleaved caspase3、Vimentin、α-SMA蛋白表達(dá)，提示三子固本顆?？赡苁峭ㄟ^(guò)降低大鼠腎臟氧化應(yīng)激、抑制凋亡和EMT作用，達(dá)到保護(hù)實(shí)驗(yàn)性糖尿病腎病大鼠的作用。
　　結(jié)論:
　　通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法確定三子固本顆粒的制備工藝，并成功建立三子固本顆粒的指紋圖譜;采用血清藥物化學(xué)方法，結(jié)合UPLC