簡(jiǎn)介：目的臨床部分對(duì)西醫(yī)診斷為病毒性肺炎的患兒進(jìn)行中醫(yī)證候?qū)W研究通過(guò)對(duì)臨床表現(xiàn)與各證型之間關(guān)系的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理建立判別函數(shù)協(xié)助辨證分型為該病辨證論治規(guī)范劃提供依據(jù)實(shí)驗(yàn)部分通過(guò)對(duì)治療小兒病毒性肺炎痰熱閉肺證的有效中藥制劑清肺口服液對(duì)腺病毒3I、7B型攻擊后人胚肺成纖維細(xì)胞中FAS表達(dá)影響的研究探討開(kāi)肺化痰解毒法治療小兒病毒性肺炎的分子學(xué)機(jī)理結(jié)論臨床部分在小兒病毒性肺炎的臨床辨證中要重視對(duì)發(fā)熱、咯痰痰鳴、氣促、鼻煽、肺部聽(tīng)診、惡寒、面色、精神、汗、咽紅、扁桃體、指紋脈象、舌質(zhì)、舌苔等對(duì)辨證分型價(jià)值較大的指標(biāo)進(jìn)行綜合分析增加辨證的準(zhǔn)確性在進(jìn)行大規(guī)模的臨床調(diào)查中可通過(guò)小兒病毒性肺炎的辨證分型判別函數(shù)輔助判斷以減少辨證分型中主觀因素的影響實(shí)驗(yàn)部分3I、7B型腺病毒對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞FAS的表達(dá)有一定的影響腺病毒可能通過(guò)此機(jī)制延長(zhǎng)其在細(xì)胞內(nèi)的存活時(shí)間以利于自身復(fù)制清肺口服液含藥血清對(duì)FAS的表達(dá)具有一定的調(diào)節(jié)作用這一作用可能是其清除病毒在體內(nèi)的感染對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用的機(jī)制之一

簡(jiǎn)介：目的近些年，我國(guó)人間狂犬病報(bào)告病例數(shù)呈遞增態(tài)勢(shì)，狂犬病已成為當(dāng)前重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題。我國(guó)關(guān)于狂犬病流行病學(xué)、病原學(xué)的深入研究較少，整體資料不全，福建省這方面的研究更是薄弱，尚不清楚我省狂犬病毒主要宿主的病毒攜帶情況和免疫情況，不清楚居民對(duì)狂犬病的認(rèn)知程度及養(yǎng)犬情況等；國(guó)內(nèi)狂犬病毒街毒株的分離報(bào)道較少，尚未見(jiàn)在福建省境內(nèi)分離出狂犬病毒的報(bào)道，對(duì)福建省境內(nèi)狂犬病毒的流行毒株及其特征尚不清楚。因此，為了更好地預(yù)防和控制狂犬病，非常有必要開(kāi)展系統(tǒng)的狂犬病流行病學(xué)研究，獲得狂犬病流行現(xiàn)狀的基礎(chǔ)資料，了解影響狂犬病發(fā)病率的主要因素；也很有必要進(jìn)行狂犬病毒流行毒株的分離鑒定、病原生物學(xué)和遺傳學(xué)特征的研究。因養(yǎng)犬?dāng)?shù)的增加導(dǎo)致犬傷患者也不斷增加，推進(jìn)和提高犬傷患者免疫后血清抗體及犬唾液帶毒的檢測(cè)方法也迫在眉捷。方法1、針對(duì)狂犬病高發(fā)的實(shí)際情況，通過(guò)系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查研究，以獲得狂犬病流行現(xiàn)狀的基礎(chǔ)資料；從生態(tài)學(xué)角度收集影響狂犬病發(fā)病率有關(guān)因素的資料，通過(guò)負(fù)二項(xiàng)回歸模型篩查出影響狂犬病發(fā)病率的主要因素。2、運(yùn)用MIT和CIT法從疑似狂犬的腦組織中進(jìn)行狂犬病毒街毒株的分離與鑒定，采取分段RTPCR的方法，對(duì)所分離的街毒株進(jìn)行序列擴(kuò)增、克隆、測(cè)序，拼接獲得全基因組序列，并運(yùn)用生物學(xué)軟件對(duì)基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析與比較；3、通過(guò)收集福建省不同時(shí)間、不同地區(qū)的犬腦組織，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)診斷，對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行N基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，結(jié)合疫情資料進(jìn)行狂犬病的分子流行病學(xué)研究。4、選取CTN株狂犬病毒糖蛋白富集表位基因片段進(jìn)行克隆、表達(dá)和純化，人工獲得狂犬病毒糖蛋白抗原，為探索犬傷患者免疫后血清抗體及犬唾液帶毒檢測(cè)方法的提高奠定基礎(chǔ)。結(jié)果1、從2000～2006年福建省每年均有人間狂犬病疫情發(fā)生，平均發(fā)病率為00710萬(wàn)。2002～2006年福建省人狂犬病報(bào)告病例，各地分布不一，夏秋季節(jié)發(fā)病相對(duì)較多，病例主要集中在30～60歲之間，男性多于女性，農(nóng)民發(fā)病人數(shù)最多。2、福建省3個(gè)調(diào)查地區(qū)的平均家庭養(yǎng)犬率約為4667％，人均養(yǎng)犬?dāng)?shù)約為013只，每家養(yǎng)犬?dāng)?shù)約為063只。家犬平均免疫率為554％。3、福建省普通群眾對(duì)狂犬病的認(rèn)知情況較差，狂犬病專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員，總體對(duì)狂犬病犬傷情況處理的知識(shí)水平較高。4、研究認(rèn)為狂犬病的發(fā)病率與犬的免疫率及普通群眾狂犬病知識(shí)認(rèn)知能力有關(guān)。犬免疫率每增加1％，5年累積發(fā)病率為原來(lái)的79％即下降了21％。普通群眾狂犬病知識(shí)認(rèn)知能力平均每增加01分，5年累積發(fā)病率為原來(lái)的80％即下降了20％。5、本研究通過(guò)RTNESTEDPCR法從表觀健康犬腦組織中檢測(cè)出狂犬病毒，并經(jīng)基因測(cè)序證實(shí)表觀健康犬?dāng)y帶狂犬病毒，為狂犬病的預(yù)防和控制提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。6、首次在福建省成功分離出狂犬病毒街毒株7株，并完成其中兩株FJ008、FJ009的生物學(xué)特性和全基因組序列測(cè)定。7、從福建省各地收集的犬腦組織標(biāo)本共89份，通過(guò)RTNESTEDPCR擴(kuò)增、純化、克隆，獲得19條包含N基因完整讀碼框的序列。根據(jù)核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸的同源性高低，把19份含有RABVRNA的標(biāo)本分為三個(gè)群組，A群組包括FJ001、FJ002、FJ003、FJ012、FJ013、FJ014；B群組包括FJ008、FJ009、FJ010、FJ011、FJ015、FJ016、FJ017、FJ018、FJ019；C群組包括FJ004、FJ005、FJ005、FJ007。各群組內(nèi)部RABVN基因的核苷酸同源性在9970～100％之間，群組間RABVN基因的核苷酸同源性在8643～8928％，各群組內(nèi)部RABVN基因的氨基酸同源性在9886～100％之間，群組間RABVN基因的氨基酸同源性在9533～9844％。結(jié)合標(biāo)本來(lái)源地，證實(shí)福建省狂犬病具有顯著的地域分布特征。8、福建省狂犬病的流行毒株與目前常用的各種疫苗株N基因序列比對(duì)同源性在8647～9889％之間，均屬于基因Ⅰ型，提示目前使用的疫苗能較好地保護(hù)福建省RABV流行毒株的感染。9、完成了重組質(zhì)粒PHTB624的高效表達(dá)和純化，獲得一批高純度的狂犬病毒糖蛋白重組抗原，應(yīng)用于犬傷患者免疫后血清抗體的檢測(cè)，與市場(chǎng)上主流試劑盒檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有明顯差異，提示該重組抗原具有較好的應(yīng)用價(jià)值。結(jié)論1、福建省近些年狂犬病高發(fā)，居民養(yǎng)犬眾多，犬免疫率低下，普通群眾狂犬病相關(guān)知識(shí)薄弱。犬免疫率低下及普通群眾狂犬病相關(guān)知識(shí)薄弱是福建省狂犬病高發(fā)的主要影響因素。2、首次在福建省成功分離出7株狂犬病毒街毒株，并完成其中兩株街毒株FJ008、FJ009的生物學(xué)特性和全基因組序列測(cè)定。3、完成福建省狂犬病毒流行毒株的基因分型和分子流行病學(xué)研究。證實(shí)福建省存在表觀健康犬?dāng)y帶狂犬病毒的現(xiàn)象，為狂犬病的預(yù)防和控制提供了有力證據(jù)。雖然福建省狂犬病具有顯著的地域分布特征，本研究發(fā)現(xiàn)福建省狂犬病的流行毒株與目前使用的各種疫苗株N基因序列比對(duì)同源性在8647～9889％之間，均屬于基因Ⅰ型，目前使用的疫苗還是可以較好地保護(hù)福建省流行毒株的感染。4、完成了重組質(zhì)粒PHTB624的高效表達(dá)和純化，獲得一批高純度的狂犬病毒糖蛋白重組抗原，應(yīng)用于犬傷患者免疫后血清抗體的檢測(cè)與市場(chǎng)上主流試劑盒檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有明顯差異，提示該重組抗原具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

簡(jiǎn)介：目的分析中國(guó)主要疫區(qū)狂犬病毒的遺傳學(xué)特征，了解中國(guó)狂犬病毒的流行株與目前使用的人用、獸用狂犬病疫苗株的差異，為有效控制狂犬病疫情提供科學(xué)依據(jù)。方法對(duì)20042005年采自我國(guó)狂犬病主要疫區(qū)河南、江蘇、湖南、廣西、貴州等5省的1074份犬腦、貓腦及其它組織樣品，以免疫熒光試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、反轉(zhuǎn)錄一巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)狂犬病毒抗原；陽(yáng)性樣品懸液接種鼠腦分離病毒；對(duì)病毒核蛋白、糖蛋白及偽基因克隆測(cè)序后以DNASTAR及MEGA生物信息學(xué)軟件進(jìn)行遺傳學(xué)分析。結(jié)果分離到20株狂犬病毒，序列分析表明20株病毒均為基因1型狂犬病毒；其中具有代表性的6株病毒與我國(guó)現(xiàn)在使用的各種疫苗在基因和蛋白質(zhì)水平上均存在不同程度的差異，與我國(guó)人用疫苗株CTN同源性較高；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，我國(guó)主要疫區(qū)的狂犬病毒與泰國(guó)、印度尼西亞、馬來(lái)西亞等東南亞狂犬病毒株處于同一分支。結(jié)論我國(guó)主要疫區(qū)宿主動(dòng)物狂犬病毒攜帶率為21％～51％；我國(guó)的狂犬病毒仍為基因1型狂犬病毒，可以明確分為三個(gè)基因亞型當(dāng)前狂犬病毒流行株與人用、獸用狂犬病疫苗株在基因和蛋白質(zhì)水平出現(xiàn)的多處變異可能會(huì)導(dǎo)致流行株毒力的增強(qiáng)以及疫苗對(duì)它們的保護(hù)效果降低。

簡(jiǎn)介：點(diǎn)擊查看更多新生小鼠輪狀病毒腹瀉病理學(xué)及分子生物學(xué)致病機(jī)制研究.pdf精彩內(nèi)容。

簡(jiǎn)介：目的病毒性心肌炎VMC是兒科的多發(fā)病近年來(lái)其發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)故倍受醫(yī)學(xué)界的重視。目前中醫(yī)藥治療在提高機(jī)體免疫力、抗病毒、改善心臟功能、消除臨床癥狀等方面具有很大優(yōu)勢(shì)。本研究擬通過(guò)探討其治療VMC的確切作用機(jī)制為治療VMC及研制其它新藥奠定基礎(chǔ)。方法采用雄性BALBC小鼠心肌注射柯薩奇病毒造成病毒性心肌炎模型分別于1、3、5、7、10、14天取心肌病理組織HE染色后觀察病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞的損傷情況隨機(jī)分組給藥后采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組小鼠血清IL4、IFNΓ細(xì)胞因子的水平觀察羚桂龍牡顆粒對(duì)病毒性心肌炎小鼠免疫平衡的影響。結(jié)果羚桂龍牡顆?？娠@著升高病毒性心肌炎小鼠IFNΓ水平7天時(shí)與正常對(duì)照組比較有顯著差異P005。結(jié)論羚桂龍牡顆粒對(duì)病毒性心肌炎患者有較好的治療作用在病毒性心肌炎小鼠急性期和恢復(fù)期時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)TH1和TH2型代表細(xì)胞因子水平使其達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡電鏡下觀察可顯著改善心肌損傷程度。由此可見(jiàn)羚桂龍牡顆粒能夠抑制病毒復(fù)制改善并修復(fù)損傷的心肌細(xì)胞有效治療病毒性心肌炎減輕患者痛苦從而達(dá)到治療病毒性心肌炎的作用。

簡(jiǎn)介：本課題研究的目的觀察轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF基因?qū)σ浦驳慕幌荡笫笠葝u的再血管化程度和生物學(xué)功能的影響方法首先構(gòu)建攜帶血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165HVEGF165基因的重組腺病毒載體ADHVEGF165然后用其轉(zhuǎn)染新鮮分離、純化的大鼠胰島檢測(cè)在體外培養(yǎng)的條件下胰島表達(dá)HVEGF165的情況最后將經(jīng)ADHVEGF165轉(zhuǎn)染的LWEIS大鼠胰島經(jīng)門(mén)靜脈移植至同基因大鼠的肝臟內(nèi)根據(jù)對(duì)供體胰島的不同處理將接受胰島移植的糖尿病受體大鼠分三組即ADHVEGF165轉(zhuǎn)染組VEGF組、空載體ADGFP轉(zhuǎn)染的對(duì)照組GFP組和未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組PBS組移植后監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血糖的變化三周以后進(jìn)行經(jīng)靜脈糖耐量試驗(yàn)IVGTT檢測(cè)增加糖負(fù)荷后不同組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血中胰島素水平的差異對(duì)受體動(dòng)物的肝臟進(jìn)行病理學(xué)檢查應(yīng)用CD34抗體、胰島素抗體行免疫組化研究分析不同組動(dòng)物肝臟內(nèi)胰島的再血管化程度及其產(chǎn)生胰島素功能的差異結(jié)果體內(nèi)實(shí)驗(yàn)MILES試驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)經(jīng)ADHVEGF165轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞大鼠胰島可以表達(dá)標(biāo)記蛋白GFP綠色熒光蛋白和HVEGF165其表達(dá)HVEGF165的量顯著高于對(duì)照組過(guò)表達(dá)HVEGF165的胰島在同基因移植后其再血管化的程度高于對(duì)照組胰島在機(jī)體糖負(fù)荷增加的情況下過(guò)表達(dá)HVEGF165的胰島使受體動(dòng)物血糖下降的速度加快其產(chǎn)生、分泌胰島素的量高于對(duì)照組結(jié)論過(guò)表達(dá)HVEGF165的大鼠胰島在同基因移植后再血管化的程度提高其維持糖尿病受體糖代謝穩(wěn)態(tài)的能力增強(qiáng)

簡(jiǎn)介：第一部分山東地區(qū)部分HIV感染者及獻(xiàn)血者人皰疹病毒8型感染的流行病學(xué)調(diào)查目的檢測(cè)山東地區(qū)部分HIVKS感染者及獻(xiàn)血者血清或血漿中抗人皰疹病毒8型HHV8IGG抗體的存在情況，并進(jìn)一步對(duì)抗HHV8陽(yáng)性標(biāo)本中HHV8DNA的存在情況進(jìn)行檢測(cè)；從而了解HHV8在我國(guó)山東地區(qū)HIV感染者及獻(xiàn)血者中的感染情況，并探討HHV8經(jīng)輸血傳播的可能性。方法86份HIVKS血清來(lái)源于山東地區(qū)HIV感染者及520份獻(xiàn)血者血漿主要來(lái)源于濟(jì)南地區(qū)中抗HHV8IGG抗體的檢測(cè)采用ELISA方法；抗HHV8陽(yáng)性標(biāo)本血清或血漿中HHV8DNA的檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)SYBRGREENⅠ熒光染料法。結(jié)果1血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果1186份HIVKS血清中抗HHV8抗體檢出率為162751486，與對(duì)照組健康獻(xiàn)血者血漿比較有顯著性差異P12520份獻(xiàn)血者血漿中抗HHV8抗體檢出率為596231520，其中男性獻(xiàn)血者血漿中抗HHV8IGG抗體的檢出率為636717120，女性獻(xiàn)血者血漿中抗HHV8IGG抗體的檢出率為553414110。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，不同性別、年齡獻(xiàn)血者血漿中抗HHV8IGG抗體的檢出率無(wú)顯著性差異P005。13HBSAG、抗HCV以及抗梅毒螺旋體獻(xiàn)血者血漿中抗HHV8IGG抗體的檢出率分別為4065、4651及6579，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，抗HHV8抗體的檢出與HBSAG、抗HCV以及抗梅毒螺旋體的檢出相關(guān)性不大P005。2PCR檢測(cè)結(jié)果所有抗HHV8陽(yáng)性標(biāo)本血清或血漿中均未檢出HHV8DNA的存在。

簡(jiǎn)介：背景乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUS，HBV感染可引起包括無(wú)癥狀攜帶、慢性乙型肝炎CHRONICHEPATITISB，CHB、肝硬化和肝癌的一系列肝臟疾病譜。全世界大約有3億人已經(jīng)成為HBV慢性攜帶者，我國(guó)的HBV感染者約為11億，約有3000萬(wàn)的乙型肝炎患者，全國(guó)每年死于與HBV感染相關(guān)肝病約30萬(wàn)人。目前尚無(wú)徹底清除HBV的理想藥物，因此HBV感染已經(jīng)成為嚴(yán)重影響我國(guó)人民健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。HBV是非常容易發(fā)生變異的DNA病毒，而基因型和亞型變異是最常見(jiàn)的HBV基因變異形式，可以影響HBV基因型間差異超過(guò)全長(zhǎng)8％序列，而且基因型的分布存在明顯的地理分布特點(diǎn)和人種差異；還有YMDD變異、前C區(qū)變異、BCP變異等點(diǎn)突變可以影響HBV的生物學(xué)功能。因?yàn)樘禺愋粤馨图?xì)胞表位EPITOPE是特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答得以激發(fā)的主要原動(dòng)力，處于免疫識(shí)別和免疫激活的核心位置1。當(dāng)變異位點(diǎn)涉及HBV表位序列時(shí)，可能會(huì)影響宿主針對(duì)HBV的免疫應(yīng)答能力。因?yàn)槟壳癏BV表位主要由歐美國(guó)家學(xué)者鑒定，這些國(guó)家的HBV基因型主要以A、D為主。以HLAA0201限制性HBCAG1827特異性CTL表位FLPSDFFPSVC1827V為例，它被認(rèn)為是表位研究中的經(jīng)典序列，是從歐、美地區(qū)的主要流行病毒株基因型A、D中鑒定出來(lái)的；而在我國(guó)HBV基因型背景下，C1827的結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了變化。鑒于HBV基因型和基因亞型之間的較大序列差異，鑒定適合我國(guó)病毒學(xué)背景研究的新表位，用合適的HBV表位序列探究我國(guó)HBV基因型變異與細(xì)胞免疫應(yīng)答規(guī)律將有重要的研究意義。目的調(diào)查在我國(guó)HBV優(yōu)勢(shì)基因型中，C1827V／I變異體的分子流行病學(xué)特點(diǎn)和在細(xì)胞免疫學(xué)研究中的差異；通過(guò)B、C基因型特異性多肽池POOL調(diào)查研究我國(guó)HBV感染者T淋巴細(xì)胞免疫特點(diǎn)，并篩選適合HBV特異性T細(xì)胞表位鑒定的調(diào)查人群；比較HBV基因型間、熱點(diǎn)變異組間T淋巴細(xì)胞免疫功能差異。方法1通過(guò)GENBANK中上傳的30條HBV基因序列分析和本室測(cè)序的20條序列以DNASIS軟件對(duì)比分析，研究C1827V／I的分布特點(diǎn)；應(yīng)用生物學(xué)軟件分析基因B、C型的C基因序列，并構(gòu)建C1827V／I變異體的PCRRFLP檢測(cè)方法；應(yīng)用生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)并比較C1827V／I與HLA分子的結(jié)合力預(yù)測(cè)分值變化；2從我室保存的全國(guó)HBV基因型調(diào)查血清庫(kù)中，選擇160份血清，通過(guò)自行構(gòu)建的PCRRFLP法檢測(cè)，并調(diào)查C1827V／I變異體的流行病學(xué)特點(diǎn)；3在我國(guó)流行分布的C18271優(yōu)勢(shì)背景下，選取南方醫(yī)院住院的57例慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細(xì)胞，應(yīng)用四聚體染色技術(shù)、體外增殖培養(yǎng)技術(shù)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)，比較外周血中C1827I特異性淋巴細(xì)胞的頻數(shù)與C1827V特異性淋巴細(xì)胞頻數(shù)的差別，以及分析兩者間T淋巴細(xì)胞功能上的差異；4檢測(cè)57例慢性乙型肝炎患者臨床常規(guī)指標(biāo)ALT、TBIL、HBVDNA以及HBV基因型，比較分析C1827V／I特異性淋巴細(xì)胞頻數(shù)與這些臨床指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系；5依據(jù)我國(guó)HBV基因型B、C中的特點(diǎn)，參考20條GENBANK序列，設(shè)計(jì)針對(duì)我國(guó)HBV基因型B、C重疊多肽；并且設(shè)計(jì)混合多肽POOL，以便在我國(guó)HBV基因背景下檢測(cè)淋巴細(xì)胞的特異性應(yīng)答反應(yīng)；6選取南方醫(yī)院感染內(nèi)科住院的38例HBV感染者的外周血淋巴細(xì)胞，以及10例健康對(duì)照者的外周血淋巴細(xì)胞，依據(jù)HBV感染的臨床特點(diǎn)將患者分成HBEAG陰性慢性乙型肝炎組、HBEAG陽(yáng)性慢性乙型肝炎組、HBV感染肝衰竭組、肝硬化組等，通過(guò)多肽誘導(dǎo)IFNΓ分泌，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，比較不同臨床組間特異性T淋巴細(xì)胞分泌功能的差異；7分析38例樣本的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，比較本研究設(shè)計(jì)的不同基因型多肽POOL間在誘導(dǎo)HBV特異性淋巴細(xì)胞分泌的差異；8檢測(cè)38例HBV感染者HBV基因型，分析B、C基因型患者間特異性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)差異；9檢測(cè)38例HBV感染者前C區(qū)變異、BCP變異，分析變異陽(yáng)性與陰性組間特異性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)差異；10收集38例HBV感染者臨床資料，分析臨床常規(guī)指標(biāo)ALT、TBIL、HBVDNA與HBV特異性淋巴細(xì)胞功能的關(guān)系；結(jié)果1通過(guò)比對(duì)GENBANK序列發(fā)現(xiàn)C1827I在各國(guó)基因B、C型的流行株中有廣泛的分布，而C1827V則在其它基因型流行株廣泛分布；2我們成功構(gòu)建了一種PCRRFLP的方法，可以在基因B、C流行區(qū)簡(jiǎn)便快捷的篩選C1827VI變異體；3通過(guò)來(lái)自全國(guó)8省市的160份血清調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在我國(guó)主要流行的B、C基因型中，C18271毒株成為主要病毒學(xué)背景，陽(yáng)性率9812％157／160；4C1827VI四聚體染色慢性乙型肝炎外周血淋巴細(xì)胞結(jié)果提示在C18271病毒學(xué)背景下HLAA2患者外周血C1827I特異性淋巴細(xì)胞較C1827V特異性淋巴細(xì)胞頻數(shù)高0335±0479％VS0221±0392％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P00125經(jīng)過(guò)C1827V／I肽誘導(dǎo)后C1827V／I四聚體及CD8雙陽(yáng)性細(xì)胞比誘導(dǎo)前明顯增殖210倍，其中C1827I誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖能力高于C1827V肽，并發(fā)現(xiàn)兩肽之間在誘導(dǎo)增殖方面存在明顯的交叉反應(yīng)；6C1827VI肽分別誘導(dǎo)12例HLAA2陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細(xì)胞并直接酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測(cè)IFNΓ分泌，兩肽均未誘導(dǎo)出陽(yáng)性斑點(diǎn)；7通過(guò)序列比對(duì)，我們?cè)O(shè)計(jì)了HBV基因B、C型覆蓋HBV全長(zhǎng)的282條重疊多肽，每肽18個(gè)氨基酸，相鄰多肽重疊10個(gè)氨基酸；并設(shè)計(jì)了10個(gè)多肽POOL，每POOL包含2234條肽，分別區(qū)分兩種HBVB／C基因型，區(qū)分HBVX、C、S和P基因區(qū)；8將38例HBV感染者和10例健康獻(xiàn)血員分成HBEAG陰性慢性乙型肝炎組G112、HBEAG陽(yáng)性慢性乙型肝炎組G211、急性肝衰竭組G35、肝硬化G48、急性HBV感染組G52、特殊HBV標(biāo)志物組G64和健康對(duì)照組G76；G7組的斑點(diǎn)均數(shù)為2208±3924SFC，確定陽(yáng)性POOL的CUTOFF10SFC；9酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)比較各組間G1G7斑點(diǎn)分布結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義X215277，P0018；在慢性HBV感染組G1G4中進(jìn)行比較，組間各樣本總斑點(diǎn)數(shù)之間差異不顯著X265，P0088，但陽(yáng)性POOL的數(shù)量差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義X292，P0027；進(jìn)一步比較G1、G2組間樣本的陽(yáng)性POOL數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Z2345，P0019，陽(yáng)性POOL病例數(shù)之間的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義X25856，P001610HBV感染各組G1G5中，有HBVDNA檢測(cè)結(jié)果的36例資料，分析ALT水平與淋巴細(xì)胞分泌IFNΓ總斑點(diǎn)均數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系，經(jīng)非參數(shù)相關(guān)檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義CC0352，P0030；LOGDNA與淋巴細(xì)胞分泌IFN?？偘唿c(diǎn)數(shù)有負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，但經(jīng)非參數(shù)相關(guān)分析無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義CC0114，P0495；11檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HBV基因B型23例比基因C型9例患者有較高的特異性淋巴細(xì)胞總斑點(diǎn)數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Z2517，P0012；分別比較兩型問(wèn)代表S基因區(qū)POOL總斑點(diǎn)數(shù)的SGENE和代表P基因區(qū)POOL總斑點(diǎn)數(shù)的PGENE差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Z2194，P0028；Z2479，P0013；而兩型間代表X基因區(qū)和C基因區(qū)的斑點(diǎn)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義Z1635，P0102；Z0728，P0467；12發(fā)現(xiàn)前C變異和BCP變異陽(yáng)性組在樣本總斑點(diǎn)數(shù)和代表C基因區(qū)的斑點(diǎn)數(shù)較對(duì)應(yīng)的陰性組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C基因區(qū)的斑點(diǎn)數(shù)在變異組中有升高趨勢(shì)；結(jié)論1C1827I毒株是我國(guó)HBV感染者的主要病毒學(xué)背景；在此背景下，外周血C1827I的特異性淋巴細(xì)胞頻數(shù)和功能與C1827V特異性淋巴細(xì)胞存在差異，如果引用C1827V而不考慮病毒學(xué)背景可能出現(xiàn)一定的誤差；2HBV基因B型患者比基因C型患者有較高的T淋巴細(xì)胞特異性應(yīng)答能力，這對(duì)于解釋HBV基因B型患者HBEAG血清自然轉(zhuǎn)陰率高于感染基因C型患者，以及基因B型較基因C型患者對(duì)抗病毒藥物有更好應(yīng)答的現(xiàn)象提供了細(xì)胞免疫學(xué)的重要依據(jù)。

簡(jiǎn)介：目的探索影響中國(guó)宮頸癌高發(fā)區(qū)宮頸癌發(fā)病的方要危險(xiǎn)因素了解高危型人乳頭狀瘤病毒HPV的感染狀況研究其宮頸癌的關(guān)系并評(píng)價(jià)HPVDNA檢測(cè)在宮頸篩查中的應(yīng)用價(jià)值方法對(duì)山西省襄垣縣1997名3525歲已婚婦女進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查內(nèi)容包括月經(jīng)婚孕、性行為及衛(wèi)生習(xí)慣等方面然后用能檢測(cè)13種高危HPV的第二代雜交捕獲試驗(yàn)檢測(cè)婦女自己采集的陰道細(xì)胞和醫(yī)生采集的宮頸細(xì)胞中的HPVDNA用SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單變量和多變量的無(wú)條件LOGISTICL回歸分析以病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)用約登指數(shù)比較HPVDNA檢測(cè)與細(xì)胞學(xué)的篩查效果KAPPA系數(shù)衡量?jī)煞N標(biāo)本HPVDNA檢測(cè)的符合度結(jié)論生殖道高危型HPV感染是當(dāng)宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變流行的主要危險(xiǎn)因素提示宮頸癌的防治重點(diǎn)應(yīng)放在防止HPV感染、對(duì)HPV感染的篩查和密切監(jiān)測(cè)已感染高危型HPV的對(duì)象HPVDNA檢測(cè)是一種較實(shí)用的宮頸癌初篩手段尤其是自己取樣HPVDNA檢測(cè)

簡(jiǎn)介：我國(guó)的中藥資源十分豐富，一些傳統(tǒng)的中藥方劑對(duì)慢性乙型肝炎具有肯定的療效，而且毒副作用輕，是有待開(kāi)發(fā)的理想藥物，尤其是單味中藥。經(jīng)過(guò)多年臨床觀察、反復(fù)篩選、不斷優(yōu)化，本研究選用從赤芍中提取的赤芍總苷，擬將其開(kāi)發(fā)為新一代的抗肝損傷和抗乙肝病毒的中藥新藥。1研究目的11采用D一氨基半乳糖DGALN和刀豆蛋白ACONA所致肝損傷的動(dòng)物模型研究赤芍總苷的保肝降酶及抗氧化作用。12在體內(nèi)外觀察赤芍總苷抗乙肝病毒作用。2實(shí)驗(yàn)步驟21赤芍總苷抗D氨基半乳糖DGALN所致的肝損傷作用。22赤芍總苷抗CONA所致的肝損傷作用。23赤芍總苷體內(nèi)抗鴨乙肝病毒的實(shí)驗(yàn)研究。24赤芍總苷體外抗乙肝病毒的實(shí)驗(yàn)研究。3實(shí)驗(yàn)方法31NIH小鼠60只，隨機(jī)分5組，分別為正常對(duì)照組，模型組，赤芍總苷高劑量組、低劑量組和聯(lián)苯雙酯組，赤芍總苷高劑量組、低劑量組和聯(lián)苯雙酯組小鼠分別灌胃給藥，1次D，連續(xù)7D，末次給藥1H后，除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠均腹腔注射DGALN800MGKG，16H后采血，檢測(cè)血清ALT、AST活性及超氧化物歧化酶SOD活性、丙二醛MDA含量，并觀察肝組織病理學(xué)變化。3250只NIH小鼠隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組、模型組、赤芍總苷高劑量組20MGKG、赤芍總苷低劑量組10MGKG和聯(lián)苯雙酯治療組。除正常對(duì)照組外，其他組于實(shí)驗(yàn)首日靜脈注射CONA20MGKG后，赤芍總苷高劑量組、低劑量組、聯(lián)苯雙酯組分別以20MGKG、10MGKG、150MGKG灌胃口服，每天1次，連續(xù)3D，末次給藥后4H，再次靜脈注射CONA20MGKG，8H后檢測(cè)血漿ALT、AST活性和TNFΑ含量，觀察肝組織病理學(xué)變化。33將先天感染鴨隨機(jī)分為4組，每組67只不等，分別為病毒對(duì)照組，ACV組，赤芍總苷高劑量組、赤芍總苷低劑量組。赤芍總苷以20MGKG、10MGKG灌胃ACV按100MGKG灌胃，共10天。對(duì)照組未做處理。分別于T、T、T、P各時(shí)間點(diǎn)采血，用斑點(diǎn)雜交法測(cè)定血清中DHBV的載量變化。34用2215細(xì)胞作為細(xì)胞模型，將赤芍總苷分為7個(gè)劑量組，上藥6D后用ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBEAG和HBSAG含量，并用MTT法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞的毒性，計(jì)算赤芍總苷的治療指數(shù)。4實(shí)驗(yàn)結(jié)果41赤芍總苷高劑量組能顯著降低DGALN所致小鼠肝損傷血清ALT、AST活性，提高肝組織勻漿SOD活性，降低MDA，明顯改善肝組織損傷的程度，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P005；赤芍總苷高劑量組肝臟病理改變明顯減輕。43赤芍總苷高劑量組在給藥第L0D時(shí)血清DHBVDNA含量有顯著性下降P005；說(shuō)明赤芍總苷在給藥第LOD在體內(nèi)有抑制DHBV作用，但是停藥后有反跳現(xiàn)象。44赤芍總苷作用于2215細(xì)胞株6D后，對(duì)2215細(xì)胞株的半數(shù)毒性濃度為017MGL，對(duì)HBSAG的半數(shù)抑制濃度為015MGL、對(duì)HBEAGI半數(shù)抑制濃度為006MGL；對(duì)HBSAG治療指數(shù)為112，對(duì)HBEAG治療指數(shù)為275。5結(jié)論51赤芍總苷對(duì)DGA1N誘導(dǎo)的小鼠肝損傷有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抗氧自由基的損傷有關(guān)。52赤芍總苷對(duì)CONA所致小鼠肝損傷具有較好的保護(hù)作用，抑制T淋巴細(xì)胞活化和TNFΑ的釋放是其主要的作用機(jī)制。53赤芍總苷具有體內(nèi)抗鴨乙肝病毒的作用，但在停用后DHBVDNA含量回升。54赤芍總苷在體外細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)HBSAG和HBEAG的分泌抑制作用分別為低效有毒和有效低毒。

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簡(jiǎn)介：輪狀病毒（ROTAVIRUS，RV）屬于呼腸病毒科（REOVIRIDAE）輪狀病毒屬（ROTAVIRUS），是一個(gè)直徑約為70NM，無(wú)包膜，具有三層衣殼蛋白組成的正二十面體雙鏈RNA病毒。RV是引起哺乳類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)及人類(lèi)腹瀉的主要病原體，每年全球因RV感染所導(dǎo)致的重癥腹瀉而死亡的兒童約600000。RV基因組包含11個(gè)分節(jié)段的雙鏈RNA，編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（VP1VP4，VP6，VP7）和6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP1NSP6）。根據(jù)結(jié)構(gòu)蛋白VP6的抗原性差異，可將已發(fā)現(xiàn)的輪狀病毒分為AG7個(gè)組，其中，A組為引起嬰幼兒腹瀉的主要病原。RVNSP1在病毒與宿主的相互作用中發(fā)揮著重要的功能。本研究運(yùn)用基因克隆和重組表達(dá)技術(shù)在大腸桿菌中表達(dá)了RVTBCHEN株NSP1蛋白，進(jìn)行了NSP1的免疫學(xué)性質(zhì)和RV感染細(xì)胞中NSP1蛋白的合成與分布以及NSP1的系統(tǒng)進(jìn)化和基因分型研究。結(jié)果表明，大腸桿菌BL21（DE3）能高效表達(dá)重組NSP1蛋白（RNSP1），RNSP1表達(dá)量約占菌體總蛋白的344％。RNSP1能誘導(dǎo)免疫豚鼠產(chǎn)生特異性血清抗體。WESTERNBLOT及免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明，抗RNSP1血清抗體能特異性識(shí)別自身蛋白，對(duì)SA11，WA株的NSP1蛋白有交叉反應(yīng)性免疫熒光結(jié)果還表明，SA11感染的MA104細(xì)胞中合成的NSP1蛋白在細(xì)胞質(zhì)中區(qū)域化聚集形成輻射狀排列的顆粒狀結(jié)構(gòu)，而WA株的NSP1不能形成此樣結(jié)構(gòu)。分子系統(tǒng)進(jìn)化研究結(jié)果表明，至今發(fā)現(xiàn)的A組RV至少可以分為16個(gè)不同的NSP1基因型，TBCHEN株NSP1為A2型。不同NSP1基因型病毒具有獨(dú)特的敏感宿主范圍，同一NSP1基因型可能感染不同種動(dòng)物，同一種動(dòng)物也可能感染不同基因型。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究NSP1蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能及其應(yīng)用開(kāi)發(fā)奠定了很好的基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：1背景和目的流感急性腦?。↖NFLUENZAACUTEENCEPHALOPATHY，IAE）是流感病毒感染的重要并發(fā)癥之一，患者在病毒感染后在呼吸道癥狀出現(xiàn)12天內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)為快速發(fā)展的認(rèn)知障礙、精神狀態(tài)改變、意識(shí)消退、昏迷等，嚴(yán)重時(shí)引起神經(jīng)后遺癥或死亡。目前，IAE的發(fā)病機(jī)制依然不明。在流感急性腦病病人的腦脊液CSF和血漿中，發(fā)現(xiàn)TNFΑ、IL1等促炎癥細(xì)胞因子的濃度升高。認(rèn)為流感急性腦病可能是因機(jī)體在感染流感病毒后釋放促炎癥因子，進(jìn)而誘導(dǎo)了細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)CNS發(fā)生以促炎癥因子和趨化因子過(guò)度釋放為特征的細(xì)胞因子風(fēng)暴（CYTOKINNESTM），引發(fā)神經(jīng)及免疫系統(tǒng)功能紊亂和CNS的免疫病理?yè)p傷13。我們前期研究發(fā)現(xiàn)流感病毒可以感染星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，并造成大量促炎細(xì)胞因子和趨化因子釋放。而由流感病毒感染膠質(zhì)細(xì)胞所釋放的大量細(xì)胞因子對(duì)正常膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)功能有何影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究利用人流感病毒H1N1和H3N2感染小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞獲得條件上清，利用條件上清刺激正常星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，檢測(cè)相關(guān)促炎細(xì)胞因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄水平變化，及TNFΑIL6IL1Β的蛋白表達(dá)水平變化，為研究IAE所伴隨的細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)放大及細(xì)胞因子風(fēng)暴提供依據(jù)。2方法21APUERTORICO834H1N1和ASHANTOU6022006H3N2流感病毒株在MDCK細(xì)胞系中的增殖、保存及病毒滴度的測(cè)定。22原代BALBC小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)，利用間接免疫熒光法鑒定細(xì)胞純度。23不同亞型流感病毒株H1N1H3N2感染星型膠質(zhì)細(xì)胞MOI2，感染6H、24H后，收獲細(xì)胞上清液。24利用超濾分子截留技術(shù)截留分子量為300KD，對(duì)細(xì)胞上清液進(jìn)行超濾，獲得條件上清液。25流感病毒血凝實(shí)驗(yàn)檢測(cè)處理后的條件上清液中流感病毒顆粒。26CCK8法檢測(cè)條件上清液對(duì)原代BALBC小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞活性的影響。27條件上清液分別刺激原代BALBC小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，24H后提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄成CDNA。REALTIMEPCR法檢測(cè)促炎細(xì)胞因子TNFΑ、IL1Β、IL6，趨化因子IP10、MCP1、MIP1轉(zhuǎn)錄水平的變化。28條件上清刺激原代BALBC小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，ELISA法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清液中促炎細(xì)胞因子TNFΑ、IL1Β、IL6的蛋白含量，WESTERNBLOTTING法檢測(cè)GFAP蛋白的表達(dá)情況。29條件上清液刺激原代BALBC小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，TRANSWELL法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移情況。3結(jié)果31通過(guò)間接免疫熒光鑒定，成功完成對(duì)原代BALBC小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞純度達(dá)95％以上。32利用空斑法檢測(cè)，H1N1和H3N2流感病毒滴度為1107PFUML。33通過(guò)血凝實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，條件上清液中無(wú)法檢測(cè)到流感病毒顆粒。34REALTIMEPCR結(jié)果表明，條件上清液分別刺激原代BALBC小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞24H后皆可誘導(dǎo)正常膠質(zhì)細(xì)胞的促炎癥因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生不同程度的上調(diào)。35CCK8檢測(cè)結(jié)果表明，條件上清液分別刺激原代BALBC小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞24H后，與對(duì)照組比較，刺激組細(xì)胞活性被抑制。36WESTERNBLOTTING法檢測(cè)結(jié)果表明，條件上清液刺激原代BALBC小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞后，GFAP蛋白表達(dá)水平發(fā)生上調(diào)。37ELISA法檢測(cè)結(jié)果表明，條件上清液刺激原代BALBC小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞后，促炎細(xì)胞因子TNFΑ、IL1Β、IL6在不同時(shí)間點(diǎn)的蛋白表達(dá)水平發(fā)生不同程度改變總體呈下降趨勢(shì)。38TRANSWELL法檢測(cè)結(jié)果表明，條件上清刺激原代BALBC小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞24H后，小膠質(zhì)細(xì)胞遷移率未發(fā)生上調(diào)。4結(jié)論41流感病毒感染星形膠質(zhì)細(xì)胞條件上清液分別刺激原代BALBC小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞后皆可誘導(dǎo)正常膠質(zhì)細(xì)胞的促炎癥因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生不同程度的上調(diào)，產(chǎn)生細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)效應(yīng)。42流感病毒感染星形膠質(zhì)細(xì)胞條件上清液分別刺激原代BALBC小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞后皆可抑制細(xì)胞活性。43流感病毒感染星形膠質(zhì)細(xì)胞條件上清液刺激原代BALBC小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞后，促炎細(xì)胞因子TNFΑ、IL1Β、IL6的蛋白表達(dá)水平在不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)生不同程度改變，總體呈下降趨勢(shì)。蛋白質(zhì)水平上，未能檢測(cè)出細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，可能與星形膠質(zhì)細(xì)胞促炎抗炎雙向細(xì)胞生物學(xué)功能有關(guān)

簡(jiǎn)介：我國(guó)有9300萬(wàn)慢性乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUSHBV感染人群慢性HBV感染可引起慢性乙型肝炎、肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌我國(guó)每年死于HBV感染相關(guān)疾病的患者約35萬(wàn)人?？笻BV治療是慢性乙型肝炎治療及阻斷其向肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌發(fā)展的重要手段核苷酸類(lèi)似物NUCLEOSTIDEANALOGSNAS是抗HBV治療的主要藥物但隨用藥時(shí)間的延長(zhǎng)病毒的耐藥問(wèn)題已成為臨床抗HBV治療的棘手問(wèn)題。1998年上市的拉米夫定LAMVIUDINELAM在我國(guó)有長(zhǎng)達(dá)13年的臨床抗HBV治療史超過(guò)120萬(wàn)慢性乙型肝炎患者曾經(jīng)應(yīng)用LAM進(jìn)行抗病毒治療由于該藥服用方便、安全治療費(fèi)用相對(duì)低等優(yōu)點(diǎn)目前仍有大量患者在服用該藥。HBV多聚酶缺乏校對(duì)活性因此在病毒復(fù)制過(guò)程中容易產(chǎn)生錯(cuò)配產(chǎn)生大量序列多樣性的病毒株形成病毒準(zhǔn)種。在藥物選擇壓力下對(duì)藥物適應(yīng)性強(qiáng)的病毒變異株可演變?yōu)閮?yōu)勢(shì)株引起病毒耐藥。NAS的作用靶位在HBV多聚酶的逆轉(zhuǎn)錄酶REVERSETRANASERT區(qū)抑制病毒的復(fù)制。引起病毒耐藥的基因變異分為原發(fā)耐藥變異PRIMARYRESISTANCEMUTATION和補(bǔ)償變異COMPENSATYMUTATION前者直接引起病毒對(duì)藥物敏感性的下降主要是RTM204V和RTM204I又被稱(chēng)為YMDD基序的YVDD和YIDD變異后者補(bǔ)償出現(xiàn)原發(fā)耐藥變異病毒株下降的病毒復(fù)制力主要是RTV173L和RTL180M常于RTM204V聯(lián)合出現(xiàn)RTL80I常于RTM204I聯(lián)合出現(xiàn)。HBV對(duì)LAM的耐藥發(fā)生率高單獨(dú)用LAM治療14年病毒耐藥變異發(fā)生率分別為17％、40、55和67。隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)用藥人群的不斷擴(kuò)大以及在許多病例中的不合理用藥方式出現(xiàn)新的或潛在LAM耐藥HBV變異株的可能性在增加。除經(jīng)典的RTM204I和RTM204V變異外出現(xiàn)其他LAM耐藥相關(guān)變異的可能性也較大。近年LAM治療應(yīng)答不佳或無(wú)應(yīng)答的患者出現(xiàn)新的YSDD和YKDD變異株的臨床研究報(bào)道已引起學(xué)者的關(guān)注。因此在臨床抗病毒治療過(guò)程中除檢測(cè)經(jīng)典耐藥變異外發(fā)現(xiàn)與鑒定潛在HBV耐藥相關(guān)變異對(duì)于全面認(rèn)識(shí)病毒耐藥與指導(dǎo)臨床合理調(diào)整抗HBV治療方案具有重要意義。目的研究臨床LAM長(zhǎng)期治療失敗的慢乙肝患者HBVRT區(qū)YMDD基序新變異RTM204Q的病毒學(xué)特點(diǎn)鑒定其與LAM耐藥的相關(guān)性。方法1、從解放軍第三〇二醫(yī)院病毒性肝炎研究室完成的大樣本HBVRT基因測(cè)定序列中結(jié)合患者用藥、病毒學(xué)和生化應(yīng)答等臨床信息篩選分析經(jīng)典耐藥變異以外的可能與LAM耐藥相關(guān)的潛在新的耐藥變異形式。2、在篩選出的10例檢出HBVYQDD變異的服用LAM患者中選取1例代表性接受LAM長(zhǎng)期治療卻失敗的慢乙肝患者樣本PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法檢出其耐藥變異形式為RTL180MRTM204IQ提取血清HBVDNA采用巢式PCR擴(kuò)增HBV全長(zhǎng)RT區(qū)基因PCR產(chǎn)物直接克隆到PGEMTEASY載體中隨機(jī)挑選40個(gè)克隆進(jìn)行DNA序列測(cè)定并分析耐藥相關(guān)變異。3、采用定點(diǎn)突變方法將HBV11倍的PTRIEX載體下游的SPHI酶切位點(diǎn)封閉再用XHOISPHI雙酶切獲得改建后的PTRIEX11HBV載體。將XHOISPHI雙酶切后的RT片段與載體連接成含HBV11倍基因組長(zhǎng)度的重組質(zhì)粒。4、將構(gòu)建的含野生株和變異株的重組質(zhì)粒經(jīng)FUGENEHD轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HEPG2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染4小時(shí)后加入不同濃度的核苷酸類(lèi)藥物隔天換藥藥物連續(xù)作用4天后收集細(xì)胞上清采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同藥物濃度下HBVDNA的復(fù)制水平分析變異株對(duì)藥物的敏感性。進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)以便驗(yàn)證。結(jié)果1、共有10例慢乙肝患者檢出YQDD變異進(jìn)一步研究的這例典型病例在LAM治療1年后出現(xiàn)病毒學(xué)突破HBVDNA載量從陰性增加到188106IUML丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT從正常水平增加到126UL。對(duì)其HBVRT區(qū)分別進(jìn)行直接測(cè)序與克隆測(cè)序顯示兩種檢測(cè)方法的結(jié)果一致在獲得的37個(gè)克隆中13個(gè)351為野生型11個(gè)297為RTM204Q變異型2個(gè)54為RTM204I變異型10個(gè)270為RTA181T變異型1個(gè)27為RTA181TRTM204Q變異型。2、定點(diǎn)突變成功改建PTRIEX11HBV載體獲得目的載體片段。XHOISPHI雙酶切HBVRT區(qū)五種變異的片段及改建的載體將兩者相連接。制備轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒。3、分別將構(gòu)建的11倍HBV野生型和RTM204Q相關(guān)變異的四種變異型重組載體轉(zhuǎn)染入HEPG2細(xì)胞檢測(cè)它們的復(fù)制力水平野生病毒株的復(fù)制力為600±0096106IUMLRTM204Q變異株、RTM204I變異株、RTA181T變異株和RTA181TRTM204Q變異株與野生株比較均有不同程度下降分別是野生株病毒復(fù)制力的8995、4628、5577和3444。4、在四種不同濃度的NAS藥物作用下評(píng)價(jià)RTM204IQ在體外細(xì)胞中表型耐藥特點(diǎn)。三次獨(dú)立重復(fù)表型耐藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RTM204Q和RTM204I變異株對(duì)阿德福韋ADV、恩替卡韋ETV和替諾福韋TDF敏感但對(duì)LAM出現(xiàn)不同程度的耐藥現(xiàn)象通過(guò)測(cè)定比較藥物的半數(shù)有效抑制濃度IC50RTM204Q、RTM204I株對(duì)LAM的敏感性較野生株分別下降了757倍和1395倍。結(jié)論1、在10例LAM用藥患者樣本的YMDD基序中檢出了與LAM耐藥高度相關(guān)的YQDD變異其中部分患者臨床表現(xiàn)出耐藥提示該變異與LAM治療和耐藥存在一定的關(guān)聯(lián)。2、病毒復(fù)制力測(cè)定表明RTM204Q變異病毒株的病毒復(fù)制力雖然較野生株有所下降但明顯高于經(jīng)典的RTM204ILAM耐藥病毒株。3、表型耐藥分析表明RTM204Q變異病毒株對(duì)LAM具有一定的抗藥性但程度低于RTM204I耐藥變異株RTM204Q和RTM204I變異株對(duì)ADV、ETV和TDF三種藥物均敏感。4、綜上結(jié)果表明RTM204Q是一種以往國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道新的LAM耐藥相關(guān)變異RTM204Q變異株可以與經(jīng)典LAM耐藥變異株同時(shí)在LAM耐藥患者中出現(xiàn)。該研究更全面地認(rèn)識(shí)HBV耐藥、幫助臨床合理治療LAM耐藥HBV感染提供了有價(jià)值的數(shù)據(jù)。

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