簡(jiǎn)介：固定化細(xì)胞可以提高細(xì)胞在反應(yīng)液中的集中度便于細(xì)胞與反應(yīng)液的分離，并有效阻止惡劣條件如PH、溫度、有毒物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的侵害，對(duì)催化細(xì)胞起到保護(hù)的作用。盡管如此，傳統(tǒng)固定化方法的固定化介質(zhì)提供的狹小空間和相對(duì)較差的傳質(zhì)和擴(kuò)散性能阻礙了細(xì)胞的生長(zhǎng)，且存在細(xì)胞泄露的缺陷。為了克服傳統(tǒng)固定化方法的缺陷，本文將微生物組織工程支架引入到固定化催化方面來(lái)。分別采用聚乙烯醇、海藻酸鈣作為支架材料，啤酒酵母為種子細(xì)胞，用聚乙烯醇有機(jī)蒙脫石納米復(fù)合凝膠分別對(duì)兩種支架進(jìn)行包衣，制備兩種不同的微生物組織工程支架。分別考察并比較兩種支架的特性以及這兩種包衣片的性質(zhì)，同時(shí)利用制備好的微生物組織工程包衣片進(jìn)行簡(jiǎn)單的乙醇催化，考察其儲(chǔ)存穩(wěn)定性及重復(fù)利用能力。首先，以聚乙烯醇蒙脫石復(fù)合物為支架材料，制備出直徑為4MM、厚度為2MM的片狀多孔支架。采用鹽浸法制孔，通過調(diào)節(jié)聚乙烯醇、蒙脫石的混合溶液與致孔劑的配比及優(yōu)化，對(duì)模型反復(fù)凍融得孔隙率為71％的三維多孔支架。以海藻酸蒙脫石復(fù)合物為支架材料，制備出直徑為8MM、厚度為2MM的碟狀多孔支架。采用石蠟微球浸出法，通過調(diào)節(jié)海藻酸鈉、蒙脫石的混合溶液與致孔劑的配比及優(yōu)化。使用氯化鈣的溶液與其進(jìn)行離子交換，經(jīng)干燥、石蠟浸出得孔隙率為93％的三維多孔支架。前者水溶液中無(wú)膨脹現(xiàn)象，后者膨脹系數(shù)為118兩種支架操作都較簡(jiǎn)單，對(duì)酵母細(xì)胞毒性小，皆適合用于酵母細(xì)胞培養(yǎng)。對(duì)兩種支架進(jìn)行擴(kuò)散分析，皆得到較好效果。其次，以兩種三維支架作為載體，用以接種啤酒酵母細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，以聚乙烯醇有機(jī)蒙脫石納米復(fù)合凝膠對(duì)生長(zhǎng)了細(xì)胞的三維支架進(jìn)行包衣，并經(jīng)過硼酸交聯(lián)和硫酸鈉硬化，得到微生物組織工程包衣片?？疾靸煞N支架的細(xì)胞載量、包衣效果，以及作為生物催化劑在不同PH和溫度下兩種包衣片細(xì)胞醇脫氫酶ALCOHOLDEHYDROGENASE，ADH的活性影響、凝膠包衣片細(xì)胞的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聚乙烯醇支架細(xì)胞載量為32MGCELLDWCM3GEL，海藻酸支架細(xì)胞載量為45MGCELLDWCM3GEL。兩種支架的包衣厚度為200～300ΜM，無(wú)細(xì)胞泄露現(xiàn)象。無(wú)論是PH還是溫度，相對(duì)于游離細(xì)胞包衣片內(nèi)細(xì)胞的耐受能力都得到明顯提高。在4℃儲(chǔ)藏一個(gè)月后，包衣片內(nèi)細(xì)胞的ADH酶的活性還保留了其最初活性的754％。最后，以PVAMMT微生物組織工程包衣片作為生物催化劑用來(lái)生物催化生產(chǎn)乙醇。對(duì)每次催化后的支架進(jìn)行再培養(yǎng)，考察其重復(fù)使用性能。每次進(jìn)行催化后ADH酶的活性都能很快恢復(fù)，范圍在98％～101％之間。

簡(jiǎn)介：在全球氣候變化的壓力下，生物能源的發(fā)展受到越來(lái)越多的關(guān)注，而沼氣厭氧發(fā)酵作為一種較為成熟的生物質(zhì)能轉(zhuǎn)化方式，得到了極大地重視和快速地發(fā)展。如何提高沼氣發(fā)酵的效率，使其規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化成為了迫在眉睫的問題。溫度是制約厭氧發(fā)酵效率的一個(gè)重要因素，而利用太陽(yáng)能給沼氣池加溫，不僅可以提高生物質(zhì)能的轉(zhuǎn)化效率，還可以減少對(duì)常規(guī)能源的過度依賴，有利于經(jīng)濟(jì)社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展。本試驗(yàn)嘗試?yán)锰?yáng)能給沼氣池加溫，以提高發(fā)酵效率。試驗(yàn)在浙江省海寧市同仁養(yǎng)殖場(chǎng)沼氣工程中設(shè)計(jì)了面積為1008M2，可以儲(chǔ)存6T熱水的太陽(yáng)能集熱裝置，利用可再生能源太陽(yáng)能來(lái)加熱河水，再將加熱的河水輸入到發(fā)酵池中，以提高池溫，促進(jìn)豬糞生物質(zhì)能的轉(zhuǎn)化率通過對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入太陽(yáng)能熱水的沼氣池產(chǎn)氣率要比對(duì)照組提高112％，同時(shí)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的沼氣成分與對(duì)照組之間沒有顯著差異。試驗(yàn)期間實(shí)驗(yàn)組通過太陽(yáng)能加熱，比對(duì)照組產(chǎn)氣量增加2540M3，豬糞的能量轉(zhuǎn)化效率提高了143％。本研究利用太陽(yáng)能提高豬糞生物質(zhì)能轉(zhuǎn)化效率，從而降低了養(yǎng)殖場(chǎng)污染物的排放，減輕保護(hù)了當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境，促進(jìn)了可持續(xù)發(fā)展；同時(shí)產(chǎn)生了良好的經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)了當(dāng)?shù)剞r(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展。在我國(guó)廣大農(nóng)村地區(qū)，這種工程模式有很好的推廣價(jià)值。

簡(jiǎn)介：因?yàn)榘朐掳褰M織解剖結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性所以半月板的損傷是很常見的骨科疾病而通過外科手術(shù)技術(shù)很少能真正地重建半月板組織。半月板是纖維軟骨組織由納米級(jí)膠原纖維交錯(cuò)相連構(gòu)成半月板結(jié)構(gòu)的基本框架從微觀上觀察它又分為三層不同結(jié)構(gòu)構(gòu)成每一層結(jié)構(gòu)的膠原纖維有各自排列模式。半月板損傷后無(wú)血液供應(yīng)部分不能再生所以研究人員嘗試?yán)媒M織工程技術(shù)來(lái)重建半月板。從目前國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)尚無(wú)一種單一材料和單一的制備技術(shù)能制備出具備半月板纖維軟骨組織特征的組織工程支架。應(yīng)用復(fù)合材料的原理和方法將具有互補(bǔ)特性的兩種或兩種以上材料按一定比例和方式組合制成兼?zhèn)錂C(jī)械強(qiáng)度、可降解性和生物相容性的復(fù)合材料并選擇適宜的制備工藝可以設(shè)計(jì)構(gòu)造出能夠滿足組織工程支架所需的結(jié)構(gòu)和性能優(yōu)化的三維復(fù)合材料支架。目前復(fù)合材料種類繁多而天然生物材料與人工合成高分子材料之間的復(fù)合顯現(xiàn)了良好的組織相容性及生物力學(xué)特性適合應(yīng)用在半月板這種組織構(gòu)造比較特殊的軟骨組織重建。在本課題中根據(jù)人工合成材料聚乳酸PLA具備一定的機(jī)械強(qiáng)度又有彈性符合半月板的“雙相”特性我們選用其作為生物材料中的基本成分為了增加它的可降解性將它與聚羥基乙酸PGA復(fù)合為了改善它的生物相容性我們又利用天然生物聚合物明膠對(duì)它進(jìn)行表面修飾。同時(shí)考慮到組織工程支架的形貌結(jié)構(gòu)對(duì)引導(dǎo)細(xì)胞增殖方向誘導(dǎo)組織形成起到關(guān)鍵作用設(shè)計(jì)制備的支架就要很好地仿生組織的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)。靜電紡絲技術(shù)能夠制備納米級(jí)的纖維結(jié)構(gòu)支架很好地仿生了細(xì)胞外基質(zhì)的膠原纖維結(jié)構(gòu)。根據(jù)前期工作改變接收板材質(zhì)為銅質(zhì)增加一個(gè)電場(chǎng)先行應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)制備聚乳酸聚羥基乙酸PLGA纖維結(jié)構(gòu)的支架作為支架基底層仿生半月板組織的細(xì)胞外基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)再在PLGA纖維結(jié)構(gòu)支架表面紡一層明膠纖維結(jié)構(gòu)支架對(duì)PLGA進(jìn)行表面修飾制成雙層結(jié)構(gòu)支架增加PLGA支架的親水性和組織相容性。制備的支架兼具機(jī)械強(qiáng)度、可降解性和組織相容性。鑒于靜電紡絲技術(shù)制備的支架達(dá)到一定厚度后因高分子材料的絕緣性和電場(chǎng)力的限制再想提高支架的厚度有相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。而熱致相分離TIPS技術(shù)使三維立體結(jié)構(gòu)支架的厚度得到大大地改觀改良的梯度熱致相分離技術(shù)又使支架孔隙的排列走向得到控制。我們選用有韌性可降解材料聚3羥基丁酸酯共聚4羥基丁酸酯POLY3HYDROXYBUTYRATEOCO4HYDROXYBUTYRATE簡(jiǎn)稱P3HBCO4HB復(fù)合聚乳酸PLA改善PLA的降解性利用梯度熱致相分離技術(shù)制備PLAP3HBCO4HB取向孔隙三維支架再結(jié)合物理吸附作用將天然生物聚合物明膠涂覆在支架表面更加改善了支架的生物相容性使其具備誘導(dǎo)細(xì)胞取向增殖促進(jìn)組織形成發(fā)揮組織工程支架的作用。第一部分靜電紡絲技術(shù)制備有機(jī)械強(qiáng)度和細(xì)胞相容性的雙層納米纖維結(jié)構(gòu)半月板組織工程支架目的1利用靜電紡絲技術(shù)制備組織工程支架。2通過明膠纖維的表面修飾提高支架生物相容性。3評(píng)估支架具備適合組織工程支架要求的物理化學(xué)性質(zhì)。方法在前期工作基礎(chǔ)上改進(jìn)靜電紡絲設(shè)備將接收板改用銅質(zhì)材料并在接收板上增加一個(gè)新的電場(chǎng)利用“層層沉積”技術(shù)先紡出一層PLGA纖維結(jié)構(gòu)支架作基底層再紡制一層明膠GELATIN纖維結(jié)構(gòu)在其表面上沉積制備雙層結(jié)構(gòu)支架。同時(shí)以純的PLGA和明膠混合PLGA分別各紡出一種纖維支架作為對(duì)照組。將三種支架的表征、親水性、降解性和機(jī)械強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)試比較。結(jié)果GELATINPLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架與另外兩種支架對(duì)比具備直徑合適的納米級(jí)纖維、有較大孔徑、較高的孔隙率、較高的親水性、滿意的降解率和良好的機(jī)械強(qiáng)度。結(jié)論明膠PLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架仿生了半月板組織細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)具備作為組織工程支架的理化特性。第二部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的半月板細(xì)胞種植支架聯(lián)合培養(yǎng)目的1提取兔的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化為半月板細(xì)胞。2將細(xì)胞種植于前面制備的三種不同的纖維結(jié)構(gòu)支架上在體外進(jìn)行培養(yǎng)。3觀察細(xì)胞在支架上的形態(tài)通過細(xì)胞增殖情況及合成分泌功能的比較分析評(píng)估不同支架的細(xì)胞相容性。方法應(yīng)用密度梯度離心法提取兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得的纖維軟骨細(xì)胞通過表征觀察和特異性染色HE、甲苯胺藍(lán)、ABPAS、Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組化染色進(jìn)行鑒定。接種細(xì)胞于三種不同支架通過觀察細(xì)胞表征、組織染色、增殖測(cè)試評(píng)估三種不同支架對(duì)細(xì)胞的相容性及對(duì)細(xì)胞特性的保持。結(jié)果提取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化成半月板纖維軟骨細(xì)胞種植于支架后能夠增殖并保持纖維軟骨細(xì)胞的表征和功能尤其在明膠PLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架上增殖顯著。結(jié)論明膠PLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架接種經(jīng)誘導(dǎo)分化的纖維軟骨細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)為組織工程技術(shù)重建半月板提供理論依據(jù)。第三部分制備具有生物相容性和機(jī)械強(qiáng)度的GELATINPLAP3HBCO4HB三維組織工程支架目的1改進(jìn)的梯度熱致相分離技術(shù)制備PLAP3HBCO4HB三維多孔取向支架。2在支架表面吸附明膠GELATIN進(jìn)行修飾制備的支架進(jìn)行表征、親水性、降解性和機(jī)械強(qiáng)度的測(cè)試評(píng)估。3支架上種植前面獲得的誘導(dǎo)分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞評(píng)估支架的細(xì)胞相容性。4與第一部分制備的GELATINPLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架進(jìn)行機(jī)械強(qiáng)度和細(xì)胞相容性方面的對(duì)比。方法應(yīng)用改進(jìn)的梯度熱致相分離技術(shù)制備PLAP3HBCO4HB三維多孔支架用物理吸附方法以明膠對(duì)支架進(jìn)行表面修飾標(biāo)記為GELATINPLAP3HBCO4HB支架制備的支架與未經(jīng)過修飾的PLAP3HBCO4HB支架進(jìn)行表征、孔隙率、降解性、親水性和機(jī)械力學(xué)性能的測(cè)試對(duì)比后種植經(jīng)誘導(dǎo)分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過觀察細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)及細(xì)胞一支架復(fù)合體的特異性染色和掃描電鏡、共聚焦顯微鏡觀察情況進(jìn)行對(duì)比分析評(píng)估明膠修飾支架在細(xì)胞相容性方面的優(yōu)越性。為了選擇更優(yōu)越的支架再與第一部分制備的GELATINPLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架進(jìn)行拉伸強(qiáng)度和細(xì)胞種植支架增殖情況的對(duì)比。結(jié)果梯度熱致相分離技術(shù)制備的三維多孔支架經(jīng)明膠修飾后具備較理想的理化性質(zhì)種植其上的經(jīng)誘導(dǎo)分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠很好地增殖并保持纖維軟骨表征。與GELATINPLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架對(duì)比有更強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度和優(yōu)越的細(xì)胞相容性。結(jié)論相比GELATINPLGA雙層纖維結(jié)構(gòu)支架明膠修飾的PLAP3HBCO4HB三維立體結(jié)構(gòu)支架更適于成為半月板組織工程支架。第四部分GELATINPLAP3HBCO4HB支架負(fù)載誘導(dǎo)分化的干細(xì)胞植入裸鼠體內(nèi)構(gòu)建纖維軟骨的實(shí)驗(yàn)研究目的檢測(cè)細(xì)胞一支架復(fù)合體植入裸鼠皮下構(gòu)建纖維軟骨組織。方法首先測(cè)試支架的安全性用支架浸提液進(jìn)行皮下刺激試驗(yàn)和急性毒性實(shí)驗(yàn)。然后將前面實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)得到的經(jīng)示蹤劑染色的誘導(dǎo)分化干細(xì)胞負(fù)載于支架上構(gòu)成復(fù)合體與單純無(wú)細(xì)胞支架植入裸鼠皮下進(jìn)行培養(yǎng)4周后在多功能活體成像系統(tǒng)下觀察確認(rèn)支架內(nèi)細(xì)胞存活、增殖。將裸鼠處死取出細(xì)胞一支架復(fù)合體制成切片進(jìn)行組織染色和免疫組化染色觀察對(duì)比。結(jié)果制備的GELATINPLAP3HBCO4HB支架是有生物相容性的是安全的。負(fù)載誘導(dǎo)分化干細(xì)胞的支架植入裸鼠皮下后可見支架內(nèi)被標(biāo)記的細(xì)胞增殖明顯細(xì)胞融合相互聯(lián)系分泌纖維軟骨細(xì)胞外基質(zhì)。在支架環(huán)境中有半月板纖維軟骨組織形成的趨勢(shì)。結(jié)論負(fù)載誘導(dǎo)分化干細(xì)胞的GELATINPLAP3HBCO4HB支架于裸鼠皮下培養(yǎng)成纖維軟骨組織為組織工程技術(shù)重建半月板提供理論依據(jù)。

簡(jiǎn)介：多殺菌素SPINOSAD是由刺糖多孢菌SACOPOLYSPASPINOSA經(jīng)有氧發(fā)酵產(chǎn)生的胞內(nèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物屬新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。多殺菌素被認(rèn)為是繼阿維菌素之后最為有效的生物殺蟲劑成為新型生物農(nóng)藥研發(fā)的熱點(diǎn)。然而由于其發(fā)酵單位低、副產(chǎn)物多、產(chǎn)品收率低導(dǎo)致生產(chǎn)成本高制約了其工業(yè)化生產(chǎn)和全面推廣應(yīng)用。因此本研究通過代謝工程的方法對(duì)多殺菌素的合成途徑進(jìn)行了改造此外還對(duì)多殺菌素合成過程中的一些關(guān)鍵問題作了研究。主要研究結(jié)果如下1本研究成功的建立了適合特定大小質(zhì)粒的刺糖多孢菌的基因操作系統(tǒng)。本研究通過已建立的刺糖多孢菌操作系統(tǒng)成功的利用一種理性設(shè)計(jì)的手段對(duì)多殺菌素合成途徑進(jìn)行了改造。首先為了使帶有鼠李糖糖苷配基的大環(huán)RAGL更多的朝著PSA合成的方向進(jìn)行基因SPNK在刺糖多孢菌中被過表達(dá)了。然后為了解決福樂糖胺合成量不夠的問題參與福樂糖胺合成的六個(gè)基因SPNPSPNOSPNNSPNQSPNR和SPNS和SPNK被共同表達(dá)在這株基因工程菌中使得積累的PSA轉(zhuǎn)化成了多殺菌素。為進(jìn)一步提高多殺菌素的產(chǎn)量在基因工程菌LU104中過表達(dá)了GTTGDHKRESPNPSPNOSPNNSPNQSPNRSPNS和SPNK基因后多殺菌素的產(chǎn)量達(dá)到了405MGL產(chǎn)量較野生菌株提高了5倍。2在本工作中選擇了8個(gè)可能的參照基因16SRRNAGAPDHTUFAHPRTRBL13RPOBUBQ和HRDB。用三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化算法BESTKEEPERGENM和NMFINDER對(duì)這8個(gè)備選參照基因進(jìn)行數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示在不同刺糖多胞菌株和不同培養(yǎng)條件下16SRRNA和RBL13的表達(dá)量均穩(wěn)定為最佳參照基因。而在鏈霉菌中常用的GAPDH和RPOB基因則不適合作為刺糖多胞菌中RTQPCR數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的參照基因。3本研究在基因水平和代謝物水平從脂肪酸Β氧化脂肪酸從頭合成和多殺菌素合成的角度解釋外源脂肪酸的添加可以提高多殺菌素產(chǎn)量的原因。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)多殺菌素合成途徑基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A的濃度增加導(dǎo)致多殺菌素產(chǎn)量的提高。本研究建立了在添加外源脂肪酸的情況下Β氧化脂肪酸從頭合成和多殺菌素合成之間的代謝關(guān)系。本研究的結(jié)果使研究人員能更好的理解添加脂肪酸可以提高聚酮化合物產(chǎn)量的原因。

簡(jiǎn)介：目前，因創(chuàng)傷、先天性畸形、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松和腫瘤等原因造成的骨缺損疾病對(duì)骨移植材料的需求日趨增加。當(dāng)前常用的骨修復(fù)材料包括自體骨移植物、異種或同種異體骨移植物以及人工合成的骨替代材料，然而這些材料均存在一定的缺陷或局限性。自體骨移植一直被視為治療骨缺損的“黃金法則”，但它受限于來(lái)源，并且存在著引起供區(qū)正常骨結(jié)構(gòu)破壞、感染和疼痛等潛在問題。異種或同種異體骨移植物具有免疫原性，會(huì)引發(fā)機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)，還可能導(dǎo)致病原體傳染。傳統(tǒng)的人工合成的骨替代材料，如羥基磷灰石或磷酸鈣陶瓷，雖然可以避免生物源性移植物的缺陷，但其僅具有填充、支持和骨傳導(dǎo)作用，不具有高的生物活性，尤其骨誘導(dǎo)能力弱，不能形成“活”的具有生物功能的骨組織。如何理想地實(shí)現(xiàn)骨缺損的修復(fù)，一直是臨床研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。如今，骨組織工程為骨缺損的修復(fù)提供了重要的選擇性策略。支架材料作為人工細(xì)胞外基質(zhì)材料是骨組織工程的核心。根據(jù)天然骨的結(jié)構(gòu)和組成，天然聚合物羥基磷灰石復(fù)合支架材料成為了研究熱點(diǎn)。生物可降解的天然衍生高分子聚合物殼聚糖CHITOSAN，由于其良好的生物相容性，生物可降解性，正電性，易化學(xué)改性性而成為僅次于膠原的最具有潛力的用于骨組織工程支架材料的天然聚合物。目前，殼聚糖羥基磷灰石骨組織工程支架材料的制備方法主要基于混合共沉淀法和原位共沉淀法。以上制備方法雖然工藝簡(jiǎn)單，卻很難在一個(gè)具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的三維支架內(nèi)實(shí)現(xiàn)表面化學(xué)組成和微觀結(jié)構(gòu)的可控調(diào)節(jié)，且使用的交聯(lián)劑戊二醛有毒，其在體內(nèi)降解過程中很容易釋放出來(lái)。此外，為了獲得與骨組織結(jié)構(gòu)類似來(lái)達(dá)到理想的力學(xué)性能和生物活性的骨支架材料，生物礦化方法已成為實(shí)現(xiàn)形貌和結(jié)晶度與天然骨相似的磷灰石在天然聚合物自組裝的重要策略。然而，目前很難利用類似在膠原表面進(jìn)行生物礦化的方法實(shí)現(xiàn)羥基磷灰石在殼聚糖基的支架材料表面組裝。因此，通過一種無(wú)毒且可控的方法實(shí)現(xiàn)具有生物活性的羥基磷灰石在殼聚糖基的支架材料表面精確組裝仍然是骨組織工程的重要挑戰(zhàn)。骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCS，作為一種成體干細(xì)胞，因具有低的免疫原性、易獲取性和多向分化潛能性已成為骨組織工程中最為理想的種子細(xì)胞之一。近來(lái)研究表明生物材料的表面特征，包括化學(xué)組成、粗糙度、微結(jié)構(gòu)，特別是納米級(jí)微結(jié)構(gòu)，可以直接影響干細(xì)胞的命運(yùn)。因此，了解骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在支架微環(huán)境的生理反應(yīng)，可以在分子水平明確支架微環(huán)境對(duì)細(xì)胞行為的影響，這為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨組織工程的應(yīng)用提供了理論依據(jù)并有助于研發(fā)具有特定生物活性的組織誘導(dǎo)性支架材料。而且，目前隨著干細(xì)胞與生物材料表面微環(huán)境相互作用的逐步廣泛認(rèn)識(shí)，組織工程逐步朝向設(shè)計(jì)和工程化具有促進(jìn)細(xì)胞特殊表型表達(dá)功能的支架材料表面的方向發(fā)展。此外，骨支架材料的表面特征，特別是考慮到對(duì)生長(zhǎng)因子例如骨形態(tài)發(fā)生蛋白2，BMP2的持續(xù)釋放，或許能夠提供一種新型而有效的藥物釋放系統(tǒng)來(lái)達(dá)到促進(jìn)成骨的目的。根據(jù)上述背景，本論文旨在通過一種無(wú)毒且可控的方法實(shí)現(xiàn)具有生物活性的羥基磷灰石在殼聚糖基的支架材料表面精確組裝，并探討該復(fù)合支架材料的表面微環(huán)境對(duì)接種的干細(xì)胞體外成骨分化潛能以及對(duì)成骨生長(zhǎng)因子如BMP2緩釋能力的影響，提供一種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的骨組織工程支架材料。本論文主要包括以下幾個(gè)方面的工作1二級(jí)三維多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)殼聚糖羥基磷灰石骨組織工程支架材料HGCCS的構(gòu)建及細(xì)胞生物相容性表征使用無(wú)毒的交聯(lián)劑京尼平GNEIPIN，根據(jù)納米籽晶誘導(dǎo)的仿生礦化方法，利用水熱合成、原位復(fù)合和冷凍干燥制備技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了羥基磷灰石在殼聚糖支架表面的組裝，并成功地制備了具有二級(jí)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的殼聚糖網(wǎng)絡(luò)HAP骨組織工程支架材料HGCCS第一級(jí)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)為殼聚糖支架構(gòu)成的三維連通的多孔結(jié)構(gòu)約150ΜM，利于細(xì)胞遷移和物質(zhì)傳輸?shù)诙?jí)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是由羥基磷灰石在孔道表面自組裝形成的納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（約150NM），為細(xì)胞的生長(zhǎng)和生理功能提供了特殊的微環(huán)境。X射線衍射XRD、高分辨投射電鏡HRTEM和傅里葉變化紅外光譜FTIR分析證實(shí)了在HGCCS孔道表面上連續(xù)的納米結(jié)構(gòu)是由結(jié)晶性的羥基磷灰石組成。使用的無(wú)毒交聯(lián)劑京尼平，賦予了復(fù)合支架材料特有的熒光特性和高的力學(xué)強(qiáng)度。羥基磷灰石納米籽晶的摻入促進(jìn)了羥基磷灰石納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在支架孔道表面的快速組裝，且共同起到了增強(qiáng)支架材料力學(xué)性能的作用。HGCCS的彈性模量EM高達(dá)5049±223MPA。利用京尼平與殼聚糖共聚物的熒光特性，開發(fā)了其在支架材料成像與示蹤以及支架材料降解過程中結(jié)構(gòu)觀察的潛在應(yīng)用。此外，其熒光特性或許為研究細(xì)胞與支架材料之間的相互作用，以及觀察細(xì)胞在支架表面的黏附、定位和遷移提供了一個(gè)有效手段。將前成骨細(xì)胞MC3T3E1接種于京尼平交聯(lián)的殼聚糖支架GCF和HGCCS上體外培養(yǎng)3天后，通過掃描電鏡SEM對(duì)細(xì)胞形貌的觀察以及通過激光掃描共聚焦顯微鏡CLSM對(duì)細(xì)胞核和細(xì)胞骨架染色后進(jìn)行觀察，證實(shí)了GCF和HGCCS具有良好的細(xì)胞生物相容性。將提取的大鼠BMSCS接種于支架材料內(nèi)，通過細(xì)胞形貌和細(xì)胞骨架組裝觀察以及細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了HGCCS具有良好的細(xì)胞生物相容性。此外，胎牛血清蛋白FETALCALFSERUM，F(xiàn)BS作為模式蛋白被用于評(píng)價(jià)了HGCCS的蛋白吸附性能。相比于GCF和京尼平交聯(lián)的殼聚糖納米羥基磷灰石復(fù)合物GCGF，HGCCS特有的孔道表面特征，包括高的比表面積、納米尺寸的結(jié)晶度以及微孔隙度促進(jìn)了FBS在支架材料表面的吸附，并為BMSCS的生長(zhǎng)獲得了更多的營(yíng)養(yǎng)。FBS在三種支架材料上的吸附結(jié)果也進(jìn)一步支持了細(xì)胞增殖結(jié)果。2體外評(píng)價(jià)BMSCS在HGCCS上的成骨分化潛能體外評(píng)價(jià)了BMSCS在HGCCS上的成骨分化潛能。在相同的體外培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)7天后，BMSCS在GCF和HGCCS上的細(xì)胞形狀和細(xì)胞骨架組裝均呈現(xiàn)出顯著的差異。BMSCS在GCF上呈現(xiàn)出成纖維形貌，具有BMSCS的典型表型，而BMSCS在HGCCS上的多角的形狀類似成骨細(xì)胞的表型。堿性磷酸酶ALP作為成骨重要標(biāo)志物之一，其活性檢測(cè)結(jié)果表明HGCCS誘導(dǎo)了更高的ALP活性?；趯?shí)時(shí)定量PCRRTPCR檢測(cè)，HGCCS誘導(dǎo)了成骨分化標(biāo)志物在MRNA水平的最高表達(dá)，分別是第7天的成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子RUNX2，第7天的骨橋蛋白OPN和第14天的骨鈣素OCN。分別培養(yǎng)7天和14天后，茜素紅染色結(jié)果證實(shí)了BMSCS在HGCCS上具有促進(jìn)礦化基質(zhì)和鈣結(jié)節(jié)形成的能力。在相同的體外培養(yǎng)條件下，相比于GCF，HGCCS表面的羥基磷灰石納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)作為重要的信號(hào)因素促進(jìn)了BMSCS的體外成骨分化。3基于具有二級(jí)三維多孔結(jié)構(gòu)的殼聚糖羥基磷灰石復(fù)合支架的表面微結(jié)構(gòu)調(diào)控BMP2緩釋及促進(jìn)BMSCS體外成骨分化體外評(píng)價(jià)了HGCCS表面特殊的羥基磷灰石納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)BMP2的吸附和長(zhǎng)期釋放作用以及對(duì)大鼠BMSCS體外成骨分化潛能的影響。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)ELISA結(jié)果表明，與對(duì)照組GCF的28％的BMP2載藥率相比，HGCCS具有65％的有效載藥率。ELISA結(jié)果還表明BMP2從HGCCS可持續(xù)釋放到第14天，而在第1和第3天BMP2在GCF上呈現(xiàn)出爆發(fā)式地釋放。進(jìn)而，BMP2從HGCCS的緩釋能力促進(jìn)了體外BMSCS的ALP活性增加?；趯?shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，BMP2荷載的HGCCS也誘導(dǎo)了成骨分化標(biāo)志物在MRNA水平的最高表達(dá)，分別是第14天的RUNX2，第3天的OPN和第14天的OCN。本次研究結(jié)果證實(shí)具有二級(jí)三維多孔結(jié)構(gòu)的HGCCS的表面羥基磷灰石納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)作為BMP2的荷載系統(tǒng)可以促進(jìn)BMSCS的體外成骨分化，表明HGCCS是具有潛在應(yīng)用價(jià)值的骨組織工程支架材料。4豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)PADM羥基磷灰石復(fù)合支架材料對(duì)大鼠顱骨臨界骨缺損修復(fù)性能的初步研究課題組前期首次利用PADM作為基礎(chǔ)材料體外構(gòu)建了具有二級(jí)三維多孔結(jié)構(gòu)的天然膠原羥基磷灰石復(fù)合支架材料，并研究了其對(duì)大鼠下頜骨臨界骨缺損的修復(fù)性能。在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建了8MM大鼠顱骨臨界骨缺損模型用于評(píng)價(jià)PADM和PADMHAP的成骨生物活性。修復(fù)5周后，MICROCT分析和組織化學(xué)染色結(jié)果表明相比于PADM，PADMHAP具有更好的骨修復(fù)能力。

簡(jiǎn)介：國(guó)內(nèi)圖書分類號(hào)TK6國(guó)際圖書分類號(hào)625碩士學(xué)位論文學(xué)校代碼10079密級(jí)公開生物質(zhì)有機(jī)廢棄物水熱解機(jī)理及資源化工程利用研究碩士研究生導(dǎo)師申請(qǐng)學(xué)位學(xué)科專業(yè)所在學(xué)院答辯日期授予學(xué)位單位曾其林李大中教授工學(xué)碩士控制科學(xué)與工程控制理論與控制工程控制與計(jì)算機(jī)工程學(xué)院2013年3月華北電力大學(xué)華北電力大學(xué)碩士學(xué)位論文原OIL“L聲明本人鄭重聲明此處所提交的碩士學(xué)位論文生物質(zhì)有機(jī)廢棄物水熱解機(jī)理及資源化工程利用研究，是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下，在華北電力大學(xué)攻讀碩士學(xué)位期間獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。據(jù)本人所知，論文中除已注明部分外不包含他人己發(fā)表或撰寫過的研究成果。對(duì)本文的研究工作做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式注明。本聲明的法律結(jié)果將完全由本人承擔(dān)。作者簽名＼萄頭揀日期％I≥年≥月7日華北電力大學(xué)碩士學(xué)位論文使用授權(quán)書生物質(zhì)有機(jī)廢棄物水熱解機(jī)理及資源化工程利用研究系本人在華北電力大學(xué)攻讀碩士學(xué)位期間在導(dǎo)師指導(dǎo)下完成的碩士學(xué)位論文。本論文的研究成果歸華北電力大學(xué)所有，本論文的研究?jī)?nèi)容不得以其它單位的名義發(fā)表。本人完全了解華北電力大學(xué)關(guān)于保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向有關(guān)部門送交論文的復(fù)印件和電子版本，允許論文被查閱和借閱一。本人授權(quán)華北電力大學(xué)，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文，可以公布論文的全部或部分內(nèi)容。本學(xué)位論文屬于請(qǐng)?jiān)谝韵孪鄳?yīng)方框內(nèi)打“寸’保密口，在T年解密后適用本授權(quán)書不保密叮作者簽名導(dǎo)師簽名博其株日期WL；年≥月7日日期跏B年弓月拿日

簡(jiǎn)介：目的探討基于乙肝病毒核心蛋白HBC的改造位點(diǎn)及形式，使形成攜帶細(xì)胞穿膜肽或配體的核心顆粒，以作為HBV感染模型改造的基礎(chǔ)。方法1用不依賴酶切連接的分子克隆方法RLIC構(gòu)建HBC、HBV11C及各種HBC改造質(zhì)粒。2將各種HBC重組體與HBV11C共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，通過提取細(xì)胞內(nèi)核心顆粒DNA，SOUTHERNBLOT檢測(cè)DNA中間體，來(lái)判斷相應(yīng)基因工程改造HBC是否支持HBV復(fù)制，形成包裹核酸的核心顆粒。結(jié)果1成功構(gòu)建在HEK293細(xì)胞內(nèi)有效支持HBV復(fù)制的WTHBC與HBV11C反式互補(bǔ)系統(tǒng)2HBC釘突部位AA7980缺失或替換不支持HBV復(fù)制3HBCAA8693缺失或替換后功能缺陷4HBCN末端插入短肽后能以較低水平支持HBV復(fù)制5HBCN末端可作為普遍有效的融合位點(diǎn)，用ABC接頭連接，可支持長(zhǎng)片段EGFP238AARFP225AA、VSVG511AA融合。結(jié)論我們構(gòu)建了有效的HBC與HBV11C反式互補(bǔ)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可檢測(cè)各種改造的HBC是否具有包裹核酸形成核心顆粒類病毒VLPS的功能。利用該系統(tǒng)，我們檢測(cè)到HBCAA7980及AA8693缺失或替換后均存在功能缺陷，這些序列可能與HBC的完整結(jié)構(gòu)及功能有關(guān)。N末端可作為有效的改造位點(diǎn)，支持各種長(zhǎng)度的外源蛋白融合，可長(zhǎng)達(dá)511AA。

簡(jiǎn)介：為了應(yīng)對(duì)石油等不可再生資源短缺的現(xiàn)狀，減少橡膠工業(yè)對(duì)化石資源的依賴，本課題通過分子設(shè)計(jì)和化學(xué)合成的方法制備了一種不依賴于石油資源的聚酯彈性體材料，其最大的特點(diǎn)就是采用分階段加料，通過雙鍵封端后再交聯(lián)的辦法改善了傳統(tǒng)方法制備的聚酯彈性體交聯(lián)點(diǎn)密度較低的缺點(diǎn)。選用13丙二醇，1，4丁二醇和癸二酸這三種生物質(zhì)單體，通過熔融縮聚的方法制備了較低分子量的端羥基聚酯，酸值測(cè)定結(jié)果顯示產(chǎn)物的端基以羥基為主，除了醇酸比13∶1，聚酯中雙端羥基組分含量均高于50％。并考察了反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、原料配比對(duì)目標(biāo)聚酯相對(duì)分子質(zhì)量的影響，并選擇醇酸比15∶1，150℃下縮聚4小時(shí)作為合成端羥基聚酯的反應(yīng)條件。之后以與端羥基聚酯摩爾比1∶2的比例加入封端單體丙烯酸，在聚酯兩端引入雙鍵，并通過紅外光譜和核磁共振氫譜對(duì)雙鍵的引入情況進(jìn)行了檢測(cè)，紅外結(jié)果顯示封端后3445CM1處的OH特征峰明顯降低，同時(shí)在1631CM1處出現(xiàn)了CC雙鍵特征峰核磁結(jié)果顯示OH峰在封端后幾乎消失，兩項(xiàng)測(cè)試結(jié)果均表明丙烯酸單體和端羥基發(fā)生了反應(yīng)，CC雙鍵被成功引入。最后以過氧化二異丙苯DCP為交聯(lián)劑，將雙鍵封端聚酯同三烯丙基異氰脲酸酯TAIC以一定配比制備了一系列彈性體材料，研究了雙鍵封端聚酯和TAIC投料比對(duì)該彈性體性能的影響，結(jié)果顯示雙鍵封端聚酯和TAIC摩爾比為3∶2時(shí)，彈性體具有最高的凝膠含量757％和最高的拉伸強(qiáng)度，且DSC和XRD曲線未出現(xiàn)明顯結(jié)晶峰。添加納米SIO2粒子進(jìn)行增強(qiáng)，并采用模壓成型，制備出了具有不同填料份數(shù)的BEE復(fù)合材料。DSC測(cè)試結(jié)果表明，SIO2的加入對(duì)升溫結(jié)晶有抑制作用，且隨著SIO2份數(shù)的增加結(jié)晶性能下降。TEM和SEM結(jié)果顯示納米SIO2在橡膠基體中分散較為均勻，表明橡膠基體與填料間具有良好的界面結(jié)合。力學(xué)測(cè)試結(jié)果表明，加入SIO2補(bǔ)強(qiáng)之后拉伸強(qiáng)度由07MPA上升到十幾MPA，且具有與已工業(yè)化的橡膠產(chǎn)品相近的優(yōu)良力學(xué)性能。BEE30PHRSIO2復(fù)合材料的透氣系數(shù)為3481017PM2S1PA1，低于含相同份數(shù)填料的丁苯橡膠和天然橡膠，表明BEE復(fù)合材料具有較好的氣體阻隔性能。

簡(jiǎn)介：學(xué)號(hào)2012309041分類號(hào)TP3115研究生類別全日制碩士碩士學(xué)位論文（專（專業(yè)學(xué)位）位）論文題目目生物工程領(lǐng)域內(nèi)的在線紅外光譜數(shù)據(jù)分生物工程領(lǐng)域內(nèi)的在線紅外光譜數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)析系統(tǒng)專業(yè)專業(yè)學(xué)位學(xué)位名稱工程名稱工程碩士碩士方向領(lǐng)域名稱軟件工程方向領(lǐng)域名稱軟件工程申請(qǐng)人姓名王麗娜王麗娜指導(dǎo)教師高玲高玲于治樓于治樓論文提交時(shí)間論文提交時(shí)間2014年5月30日獨(dú)創(chuàng)聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得（注如沒有其他需要特別聲明的，本欄可空）或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)學(xué)校學(xué)?？梢詫W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。（保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書）學(xué)位論文作者簽名導(dǎo)師簽字簽字日期20年月日簽字日期20年月日

簡(jiǎn)介：人生長(zhǎng)激素HUMANGROWTHHMONE，HGH對(duì)人體的生長(zhǎng)和發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)作用，生長(zhǎng)激素的缺乏會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)障礙等疾病的發(fā)生，含HGH類藥物可治療上述疾病。目前，臨床應(yīng)用的HGH主要通過DNA重組技術(shù)在大腸桿菌ECOLI中表達(dá)獲得。酵母屬于真核生物，在真核蛋白表達(dá)和分離純化工藝方面比大腸桿菌更有優(yōu)勢(shì)。本文選用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，通過構(gòu)建高效表達(dá)的重組人生長(zhǎng)激素RECOMBINANTHUMANGROWTHHMONE，RHGH工程菌、優(yōu)化表達(dá)條件、研究分離純化工藝，并初步測(cè)定其生物學(xué)作用。本文對(duì)HGH的CDNA序列進(jìn)行設(shè)計(jì)和優(yōu)化，并進(jìn)行人工合成，采用3種質(zhì)粒PPIC9、PPIC9K、PPICZΑA作為目的基因的表達(dá)載體，通過電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至3種畢赤酵母X33、GS115、SMD1168中進(jìn)行表達(dá)，并對(duì)不同載體宿主組合的表達(dá)量差異進(jìn)行比較。采用表達(dá)量最高的組合X33和PPICZΑA組合，簡(jiǎn)稱XZΑ進(jìn)行了1L搖瓶和3L發(fā)酵罐發(fā)酵條件的優(yōu)化，并對(duì)其分離純化工藝進(jìn)行研究，最后在體外對(duì)RHGH的生物學(xué)作用進(jìn)行初步測(cè)定。研究結(jié)果包括1研究不同載體宿主組合對(duì)RHGH表達(dá)量的影響，結(jié)果表明，在X33與PPICZΑA組合時(shí)RHGH表達(dá)量達(dá)到最高。2對(duì)1L和3L規(guī)模的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，在1L搖瓶規(guī)模時(shí)，最佳誘導(dǎo)溫度和PH為23℃和PH60在23℃、PH60進(jìn)行3L發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí)，當(dāng)采用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基BASALSALTSMEDIUM，BSM時(shí)表達(dá)量最高為3000MGL左右，較大腸桿菌表達(dá)RHGH的量高。3對(duì)RHGH分離純化工藝進(jìn)行研究，最終經(jīng)高速冷凍離心、雙水相、超濾以及離子交換層析處理后，獲得了收率大于60％，純度高于90％的RHGH。4對(duì)獲得的RHGH初步進(jìn)行生物學(xué)活性測(cè)定，結(jié)果表明，RHGH對(duì)人正常肝細(xì)胞QSG7701和人肝癌細(xì)胞BEL7402的生長(zhǎng)和增殖具有促進(jìn)作用。本研究獲得的RHGH具有表達(dá)量高，純化工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，并初步研究其生物學(xué)作用，為RHGH的畢赤酵母產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文密級(jí)畢赤酵母瞎基工程改造及WFDC2生物學(xué)活曲榭THERESEARCHOFGLYCOSYLATIONENGINEERINGINPICHIAPASTORISANDCHARACTERIZATIONOF、ⅦDC2博士研究生學(xué)號(hào)指導(dǎo)教師指導(dǎo)小組華玲201130201003L操繼躍教授操繼躍教授何啟蓋教授邱銀生教授丁明星教授王大菊教授周洪波教授專業(yè)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究方向獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)獲得學(xué)位名稱農(nóng)學(xué)博士獲得學(xué)位時(shí)間2014年12月華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院與動(dòng)物醫(yī)學(xué)院二。一四年十二月畢赤酵母糖基工程改造及WFDC2生物學(xué)活性的探討目錄摘要IABSTRACTIII縮略詞表VI前言11畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)111畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)112酵母的N糖基化途徑213畢赤酵母N糖基化改造的研究進(jìn)展52糖基化對(duì)蛋白藥物的影響73乳清酸4二硫化蛋白WFDC2～84本課題的研究目的11第一章畢赤酵母糖基工程改造12一畢赤酵母糖基工程改造刈CHL基因的敲除12前言121材料1211菌種與質(zhì)粒一1212工具酶、抗體1213主要試劑及試劑盒一1314主要儀器一1315培養(yǎng)基1516主要溶液162試驗(yàn)方法1721PZBMFC2正反向篩選載體的構(gòu)建和鑒定一1722畢赤酵母KM71OCHL基因敲除質(zhì)粒PBMZOCHL的構(gòu)建和鑒定2423敲除畢赤酵母KM71的OCHL基因2824OCHL基因敲除菌株的表型鑒定2925表達(dá)載體PPICZAAWFDC2的構(gòu)建30

簡(jiǎn)介：西南交通大學(xué)碩士學(xué)位論文物化與生物組合工藝及其在印染廢水工程中的應(yīng)用研究姓名周長(zhǎng)玖申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專業(yè)環(huán)境工程指導(dǎo)教師付永勝鄧良偉20030401西南交通大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第1T頁(yè)ABSTRACTTHEIMPORTANTPARTSOFENVIRONMENTPOLLUTIONAREWATERPOLLUTIONINWORLDPRINTINGDYEINGWASTEWATERISAMAJORPARTOFINDUSTRIALWATERPOLLUTION，POSSESSING“THREEHIGHONEDIMCULTONECHANGE”CHARACTERSOFHIGHCHROMATIONHIGHBIOCHEMICALINDEX，HIGHPH，DIFFICULTLYREDUCING，CHANGINGPARAMETERBASEDONDATAANALYSIS，DETERMININGTESTPLAN，CARRYINGOUTLOCALTESTANALYSIS，RESEARCHINGCHARACTERISTICOFPRINTINGDYEING，KINETICSOFBIOCHEMICALTREATMENTANDCORNPLEXPROCESSOFWASTEWATERTREATMENTUSINGNEUTRALIZATIONTHEORYPHYSICALCHEMISTRYANAEROBICANDAEROBICTECHNOLOGYTHEPROCESSWASUTILIZEDTOTHEPROJECTOFWASTEWATERTREATMENTINCHENGDUSHUANGJIPRINTINGDYEINGFACTORYTESTINGPHCHANGINGFORWASTEGASNEUTRALIZATION，CHROMATIONREMOVALFORCHEMICALFLOCCULATION，BIOCHEMICALINDEXFORABRANDREMOVALRATEOFORGANICMATTERFORSBRTHERESULTSISTHATINWASTEG觴NEUTRALIZATIONUNIT，PHCHANGESFORM105TO80INCHEMICALFLOCCULATIONUNITREMOVALRATEOFCHROMATIONCODANDBODIS60％AND60％AND30％INABRUNIT，REMOVALRATEOFCHROMATION，CODANDBODIS57％AND45％AND30％INSBRUNITREMOVALRATEOFCHROMATIONCODANDBODIS66％AND83％AND93％INWHOLECOMPLEXPROCESS，REMOVALRATEOFALLPOLLUTIONINDEXESISUPTO90％。A11PARAMETERSINTREATEDWASTEWATERISUPTODISCHARGELEVEL11LERESULTSFORAPPLYINGTHECOMPLEXPROCESSINACTUALENGINEERINGPROJECTSJSTHEFACTTHATCONFIRMSTHEVALIDITYOFWASTEGASNEUTRALIZATION，THEPMCTICABILITYOFFLOCCULATINGTECHNOLOGYTHEPROGRESSOFABRTECHNOLOGYANDTHERATIONALITYOFSBRTECHNOLOGYINDICATESTHATTHENEWPROCESSPROVIDES血ELOWRURMINGCOSKSIMPIEMANAGEMENTHIGHREMOVALRATEFORTHECHROMATIOM，BOD5，COD，SSINWASTEWATERTHEREBYTHENEWPROCESSWILIBECOMEACOMMENDATORYPROCESSFORTREATINGPRINTINGDYEINGWASTEWATERKEYWORDSFLOCCUATION，ABR／SBR，NEWCOMPLEXPROCESS，ENGINEERINGAPPLICATION

簡(jiǎn)介：隨著化石能源日益消耗，生物乙醇受到越來(lái)越多的關(guān)注。利用耐熱酵母KLUYVEROMYCESMARXIANUS進(jìn)行同時(shí)糖化與發(fā)酵SSF生物質(zhì)既能提高生物質(zhì)的利用率又能降低發(fā)酵過程中的能源成本。本課題對(duì)KMARXIANUS菌株進(jìn)行基因工程操作改造以提高其對(duì)木糖和淀粉的發(fā)酵能力。為了提高KMARXIANUS的木糖發(fā)酵能力，我們克隆了木糖還原酶（KMXYL1），木糖脫氫酶（KMXYL2）和木酮糖激酶（KMXYL3）3個(gè)基因并進(jìn)行性質(zhì)研究，敲除KMARXIANUSYHJ010菌株的木糖還原酶基因和木糖脫氫酶基因使YHJ010菌株失去木糖利用能力得到Y(jié)RL002菌株，再通過引入來(lái)自PINOMYCES的的木糖異構(gòu)酶基因XYLA使YRL002菌株重新獲得木糖利用能力并得到Y(jié)RL003菌株。通過在木糖合成培養(yǎng)基中馴化提高木糖利用能力，得到Y(jié)RL005菌株。YRL005菌株在木糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率可達(dá)0137H，并能在42℃發(fā)酵3015GL木糖生產(chǎn)1152GL乙醇，在45℃發(fā)酵166GL木糖生產(chǎn)521GL乙醇。除此之外，YRL005菌株還能利用玉米芯水解液在42℃發(fā)酵2004GL木糖獲得825GL乙醇。YRL005菌株是一個(gè)很好的發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇的耐熱酵母平臺(tái)。KMARXIANUS并不能直接發(fā)酵淀粉。在KMARXIANUSYZB010菌株中表達(dá)ASPERGILLUSYZAE來(lái)源的Α淀粉酶和DEBARYOMYCESOCCIDENTALIS來(lái)源的Α淀粉酶和糖化酶，獲得了可在較高溫度下＞40℃利用未經(jīng)糊化的生淀粉發(fā)酵的YRL009菌株。在42℃，YRL009菌株發(fā)酵200GL木薯淀粉生產(chǎn)6652GL乙醇。如果提高起始接菌量，產(chǎn)量可達(dá)理論產(chǎn)值的783％7995GL，而在45℃和48℃，發(fā)酵200GL木薯淀粉可分別生產(chǎn)5536GL和3216GL乙醇。除此之外，YRL009菌株還可以直接發(fā)酵木薯干粉。在不添加任何營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中，200GL木薯干粉（實(shí)含17852GL木薯淀粉）可生產(chǎn)6973GL乙醇。YRL009菌株，是已發(fā)表文獻(xiàn)中是最好的能夠利用生淀粉的耐熱CBP酵母菌株。

簡(jiǎn)介：異戊二烯是自然界分布最為廣泛、種類最為多樣化的大類生物有機(jī)化合物類異戊二烯的合成單體，同時(shí)作為合成化學(xué)工業(yè)的基礎(chǔ)原料，被廣泛應(yīng)用于合成橡膠、醫(yī)藥、香料和農(nóng)藥等領(lǐng)域。目前工業(yè)上異戊二烯的供應(yīng)主要依賴于石油基原料，其綠色清潔生產(chǎn)仍然是當(dāng)前可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略中的一大挑戰(zhàn)。大腸桿菌和釀酒酵母遺傳背景清楚、操作簡(jiǎn)便，是工業(yè)生產(chǎn)中的理想模式微生物。因此，本研究采用大腸桿菌和釀酒酵母作為宿主菌，對(duì)微生物中異戊二烯的生物合成進(jìn)行研究。在利用大腸桿菌生物合成異戊二烯的研究中，首先，通過引入外源的異戊二烯合酶在大腸桿菌中構(gòu)建一條異戊二烯生物合成途徑，并通過單個(gè)基因的過表達(dá)，確定了MEP途徑中的關(guān)鍵酶（DXSDXR和IDI），其影響力順序?yàn)镮DI＞DXS＞DXR其次，結(jié)合不同相容質(zhì)粒共存體系及多順反子方法，構(gòu)建了載體形式的多基因共表達(dá)體系，實(shí)現(xiàn)了ISPS、DXS、DXR、IDI多個(gè)限速酶的共表達(dá)，并就多基因協(xié)同作用對(duì)代謝產(chǎn)物的影響進(jìn)行了探索然后，采用基因順序調(diào)控對(duì)MEP途徑進(jìn)行了平衡調(diào)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)順序?qū)Ξ愇於┑慕K產(chǎn)量具有重要影響，當(dāng)基因表達(dá)順序與代謝途徑順序一致時(shí)，代謝產(chǎn)物積累量最高最后，結(jié)合蛋白質(zhì)工程和代謝工程，提出了關(guān)鍵酶的共定向進(jìn)化策略，異戊二烯的生產(chǎn)率提高了60％，達(dá)到418MGG1H1細(xì)胞干重，DCWDRYCELLWEIGHT。在利用釀酒酵母作為工程菌株生產(chǎn)高附加值生物化學(xué)品時(shí)，多基因途徑的快速、穩(wěn)定組裝是生物合成中的一大瓶頸。為此，我們首先建立了一套即插即用、選擇標(biāo)記可循環(huán)使用的整合工具盒PUMRI。為了證實(shí)其有效性，將其應(yīng)用于構(gòu)建4個(gè)基因的Β胡蘿卜素合成途徑～10KBDNA，8個(gè)基因的MVA途徑～17KBDNA和11個(gè)基因的番茄紅素生物合成途徑～22KBDNA。結(jié)合GAL調(diào)控系統(tǒng)，最終獲得了兩株類異戊二烯高產(chǎn)菌株，其中YCAROTENE01菌株的胡蘿卜素含量達(dá)到163MGGDCW，BY4742C04菌株的角鯊烯含量達(dá)到39MGGDCW。作為MVA途徑的前體物質(zhì)，乙酰輔酶A的充足供應(yīng)對(duì)于類異戊二烯的積累是非常重要的，為此我們就細(xì)胞質(zhì)和線粒體兩個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行了代謝工程調(diào)控。在細(xì)胞質(zhì)的調(diào)控中，我們針對(duì)MVA途徑、乙酰輔酶A合成途徑及異戊二烯合成支路三個(gè)代謝模塊，提出了推拉敲的組合調(diào)控策略，確定并解除了各個(gè)模塊中的限速節(jié)點(diǎn)。綜合調(diào)控后異戊二烯的產(chǎn)量達(dá)到185MGL，提高了394倍。在線粒體的調(diào)控中，首先，以GFP作為報(bào)告基因進(jìn)行了熒光定位表征，建立了線粒體的基因定位策略。然后，將線粒體定位序列引入PURMI工具盒，在線粒體內(nèi)構(gòu)建了一條MVA途徑。為了提高異戊二烯的產(chǎn)量并緩解MVA途徑在線粒體內(nèi)構(gòu)建后造成的中間代謝積累對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成的毒性，采用了GAL調(diào)控和好氧調(diào)控策略，異戊二烯的產(chǎn)量達(dá)到133MGL，該結(jié)果證實(shí)了線粒體調(diào)控的有效性。最后，將線粒體和細(xì)胞質(zhì)兩個(gè)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了協(xié)同調(diào)控，最終異戊二烯的產(chǎn)量達(dá)到158MGL。本文以多基因表達(dá)方法及整合工具的建立為基礎(chǔ)，結(jié)合蛋白質(zhì)工程及多種代謝調(diào)控策略，有效地提高了微生物中的異戊二烯的生物合成效率，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。

簡(jiǎn)介：WUHANINSTITUTEOFTECHNOLOGY碩士學(xué)位論文碩士學(xué)位論文啤酒污泥生物營(yíng)養(yǎng)劑的制備及工程啤酒污泥生物營(yíng)養(yǎng)劑的制備及工程化應(yīng)用研究化應(yīng)用研究學(xué)科專業(yè)學(xué)科專業(yè)環(huán)境工程環(huán)境工程研究生生劉政指導(dǎo)教師指導(dǎo)教師明銀安明銀安副教授副教授校外導(dǎo)師楊文斌校外導(dǎo)師楊文斌高級(jí)工程師高級(jí)工程師培養(yǎng)單位化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院培養(yǎng)單位化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院二○一五○一五年五月分類號(hào)分類號(hào)X7035X7035學(xué)校代號(hào)學(xué)校代號(hào)1049010490學(xué)號(hào)201303035201303035武漢工程大學(xué)碩士學(xué)位論文啤酒污泥生物營(yíng)養(yǎng)劑的制備及工程化啤酒污泥生物營(yíng)養(yǎng)劑的制備及工程化應(yīng)用研究應(yīng)用研究作者姓名劉政指導(dǎo)教師姓名、職稱明銀安副教授校外導(dǎo)師姓名、職稱楊文斌高工申請(qǐng)學(xué)位類別工程碩士學(xué)科專業(yè)名稱環(huán)境工程研究方向水污染控制論文提交日期20153論文答辯日期2015528學(xué)位授予單位武漢工程大學(xué)學(xué)位授予日期年月日答辯委員會(huì)主席張彩香