具有二級(jí)三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的殼聚糖-羥基磷灰石骨組織工程復(fù)合支架材料的構(gòu)建及其生物性能研究.pdf

1、目前，因創(chuàng)傷、先天性畸形、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松和腫瘤等原因造成的骨缺損疾病對(duì)骨移植材料的需求日趨增加。當(dāng)前常用的骨修復(fù)材料包括自體骨移植物、異種或同種異體骨移植物以及人工合成的骨替代材料，然而這些材料均存在一定的缺陷或局限性。自體骨移植一直被視為治療骨缺損的“黃金法則”，但它受限于來(lái)源，并且存在著引起供區(qū)正常骨結(jié)構(gòu)破壞、感染和疼痛等潛在問(wèn)題。異種或同種異體骨移植物具有免疫原性，會(huì)引發(fā)機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)，還可能導(dǎo)致病原體傳染。傳統(tǒng)的人工合成

2、的骨替代材料，如羥基磷灰石或磷酸鈣陶瓷，雖然可以避免生物源性移植物的缺陷，但其僅具有填充、支持和骨傳導(dǎo)作用，不具有高的生物活性，尤其骨誘導(dǎo)能力弱，不能形成“活”的具有生物功能的骨組織。如何理想地實(shí)現(xiàn)骨缺損的修復(fù)，一直是臨床研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　 如今，骨組織工程為骨缺損的修復(fù)提供了重要的選擇性策略。支架材料作為人工細(xì)胞外基質(zhì)材料是骨組織工程的核心。根據(jù)天然骨的結(jié)構(gòu)和組成，天然聚合物/羥基磷灰石復(fù)合支架材料成為了研究熱點(diǎn)。生物可

3、降解的天然衍生高分子聚合物殼聚糖(chitosan)，由于其良好的生物相容性，生物可降解性，正電性，易化學(xué)改性性而成為僅次于膠原的最具有潛力的用于骨組織工程支架材料的天然聚合物。目前，殼聚糖/羥基磷灰石骨組織工程支架材料的制備方法主要基于混合共沉淀法和原位共沉淀法。以上制備方法雖然工藝簡(jiǎn)單，卻很難在一個(gè)具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的三維支架內(nèi)實(shí)現(xiàn)表面化學(xué)組成和微觀結(jié)構(gòu)的可控調(diào)節(jié)，且使用的交聯(lián)劑戊二醛有毒，其在體內(nèi)降解過(guò)程中很容易釋放出來(lái)。此外，為了獲得

4、與骨組織結(jié)構(gòu)類似來(lái)達(dá)到理想的力學(xué)性能和生物活性的骨支架材料，生物礦化方法已成為實(shí)現(xiàn)形貌和結(jié)晶度與天然骨相似的磷灰石在天然聚合物自組裝的重要策略。然而，目前很難利用類似在膠原表面進(jìn)行生物礦化的方法實(shí)現(xiàn)羥基磷灰石在殼聚糖基的支架材料表面組裝。因此，通過(guò)一種無(wú)毒且可控的方法實(shí)現(xiàn)具有生物活性的羥基磷灰石在殼聚糖基的支架材料表面精確組裝仍然是骨組織工程的重要挑戰(zhàn)。
　　 骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)，作為一種成體干細(xì)胞，因具有低的

5、免疫原性、易獲取性和多向分化潛能性已成為骨組織工程中最為理想的種子細(xì)胞之一。近來(lái)研究表明生物材料的表面特征，包括化學(xué)組成、粗糙度、微結(jié)構(gòu)，特別是納米級(jí)微結(jié)構(gòu)，可以直接影響干細(xì)胞的命運(yùn)。因此，了解骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在支架微環(huán)境的生理反應(yīng)，可以在分子水平明確支架微環(huán)境對(duì)細(xì)胞行為的影響，這為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨組織工程的應(yīng)用提供了理論依據(jù)并有助于研發(fā)具有特定生物活性的組織誘導(dǎo)性支架材料。而且，目前隨著干細(xì)胞與生物材料表面微環(huán)境相互作用的逐步廣泛

6、認(rèn)識(shí)，組織工程逐步朝向設(shè)計(jì)和工程化具有促進(jìn)細(xì)胞特殊表型表達(dá)功能的支架材料表面的方向發(fā)展。此外，骨支架材料的表面特征，特別是考慮到對(duì)生長(zhǎng)因子(例如骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2，BMP-2)的持續(xù)釋放，或許能夠提供一種新型而有效的藥物釋放系統(tǒng)來(lái)達(dá)到促進(jìn)成骨的目的。
　　 根據(jù)上述背景，本論文旨在通過(guò)一種無(wú)毒且可控的方法實(shí)現(xiàn)具有生物活性的羥基磷灰石在殼聚糖基的支架材料表面精確組裝，并探討該復(fù)合支架材料的表面微環(huán)境對(duì)接種的干細(xì)胞體外成骨分化潛能以

7、及對(duì)成骨生長(zhǎng)因子(如BMP-2)緩釋能力的影響，提供一種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的骨組織工程支架材料。本論文主要包括以下幾個(gè)方面的工作:
　　 1.二級(jí)三維多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)殼聚糖/羥基磷灰石骨組織工程支架材料(HGCCS)的構(gòu)建及細(xì)胞生物相容性表征
　　 使用無(wú)毒的交聯(lián)劑京尼平(Gneipin)，根據(jù)納米籽晶誘導(dǎo)的仿生礦化方法，利用水熱合成、原位復(fù)合和冷凍干燥制備技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了羥基磷灰石在殼聚糖支架表面的組裝，并成功地制備了具有二級(jí)三

8、維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的殼聚糖網(wǎng)絡(luò)/HAp骨組織工程支架材料(HGCCS):第一級(jí)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)為殼聚糖支架構(gòu)成的三維連通的多孔結(jié)構(gòu)(約150μm)，利于細(xì)胞遷移和物質(zhì)傳輸;第二級(jí)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是由羥基磷灰石在孔道表面自組裝形成的納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（約150nm），為細(xì)胞的生長(zhǎng)和生理功能提供了特殊的微環(huán)境。
　　 X射線衍射(XRD)、高分辨投射電鏡(HRTEM)和傅里葉變化紅外光譜(FTIR)分析證實(shí)了在HGCCS孔道表面上連續(xù)的納米結(jié)構(gòu)是由結(jié)晶性的羥基磷

9、灰石組成。使用的無(wú)毒交聯(lián)劑京尼平，賦予了復(fù)合支架材料特有的熒光特性和高的力學(xué)強(qiáng)度。羥基磷灰石納米籽晶的摻入促進(jìn)了羥基磷灰石納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在支架孔道表面的快速組裝，且共同起到了增強(qiáng)支架材料力學(xué)性能的作用。HGCCS的彈性模量(EM)高達(dá)50.49±2.23MPa。利用京尼平與殼聚糖共聚物的熒光特性，開(kāi)發(fā)了其在支架材料成像與示蹤以及支架材料降解過(guò)程中結(jié)構(gòu)觀察的潛在應(yīng)用。此外，其熒光特性或許為研究細(xì)胞與支架材料之間的相互作用，以及觀察細(xì)胞在支架

10、表面的黏附、定位和遷移提供了一個(gè)有效手段。
　　 將前成骨細(xì)胞MC3T3-E1接種于京尼平交聯(lián)的殼聚糖支架(GCF)和HGCCS上體外培養(yǎng)3天后，通過(guò)掃描電鏡(SEM)對(duì)細(xì)胞形貌的觀察以及通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)對(duì)細(xì)胞核和細(xì)胞骨架染色后進(jìn)行觀察，證實(shí)了GCF和HGCCS具有良好的細(xì)胞生物相容性。將提取的大鼠BMSCs接種于支架材料內(nèi)，通過(guò)細(xì)胞形貌和細(xì)胞骨架組裝觀察以及細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了HGCCS具有良好的細(xì)胞

11、生物相容性。此外，胎牛血清蛋白(fetalcalfserum，F(xiàn)BS)作為模式蛋白被用于評(píng)價(jià)了HGCCS的蛋白吸附性能。相比于GCF和京尼平交聯(lián)的殼聚糖/納米羥基磷灰石復(fù)合物(GCGF)，HGCCS特有的孔道表面特征，包括高的比表面積、納米尺寸的結(jié)晶度以及微孔隙度促進(jìn)了FBS在支架材料表面的吸附，并為BMSCs的生長(zhǎng)獲得了更多的營(yíng)養(yǎng)。FBS在三種支架材料上的吸附結(jié)果也進(jìn)一步支持了細(xì)胞增殖結(jié)果。
　　 2.體外評(píng)價(jià)BMSCs在HG

12、CCS上的成骨分化潛能
　　 體外評(píng)價(jià)了BMSCs在HGCCS上的成骨分化潛能。在相同的體外培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)7天后，BMSCs在GCF和HGCCS上的細(xì)胞形狀和細(xì)胞骨架組裝均呈現(xiàn)出顯著的差異。BMSCs在GCF上呈現(xiàn)出成纖維形貌，具有BMSCs的典型表型，而B(niǎo)MSCs在HGCCS上的多角的形狀類似成骨細(xì)胞的表型。堿性磷酸酶(ALP)作為成骨重要標(biāo)志物之一，其活性檢測(cè)結(jié)果表明HGCCS誘導(dǎo)了更高的ALP活性?；趯?shí)時(shí)定量PCR(R

13、T-PCR)檢測(cè)，HGCCS誘導(dǎo)了成骨分化標(biāo)志物在mRNA水平的最高表達(dá)，分別是第7天的成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子(Runx2)，第7天的骨橋蛋白(OPN)和第14天的骨鈣素(OCN)。分別培養(yǎng)7天和14天后，茜素紅染色結(jié)果證實(shí)了BMSCs在HGCCS上具有促進(jìn)礦化基質(zhì)和鈣結(jié)節(jié)形成的能力。在相同的體外培養(yǎng)條件下，相比于GCF，HGCCS表面的羥基磷灰石納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)作為重要的信號(hào)因素促進(jìn)了BMSCs的體外成骨分化。
　　 3.基于具有二級(jí)

14、三維多孔結(jié)構(gòu)的殼聚糖/羥基磷灰石復(fù)合支架的表面微結(jié)構(gòu)調(diào)控BMP-2緩釋及促進(jìn)BMSCs體外成骨分化
　　 體外評(píng)價(jià)了HGCCS表面特殊的羥基磷灰石納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)BMP-2的吸附和長(zhǎng)期釋放作用以及對(duì)大鼠BMSCs體外成骨分化潛能的影響。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)結(jié)果表明，與對(duì)照組GCF的28％的BMP-2載藥率相比，HGCCS具有65％的有效載藥率。ELISA結(jié)果還表明BMP-2從HGCCS可持續(xù)釋放到第14天，而在第1和第3

15、天BMP-2在GCF上呈現(xiàn)出爆發(fā)式地釋放。進(jìn)而，BMP-2從HGCCS的緩釋能力促進(jìn)了體外BMSCs的ALP活性增加?；趯?shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，BMP-2荷載的HGCCS也誘導(dǎo)了成骨分化標(biāo)志物在mRNA水平的最高表達(dá)，分別是第14天的Runx2，第3天的OPN和第14天的OCN。本次研究結(jié)果證實(shí)具有二級(jí)三維多孔結(jié)構(gòu)的HGCCS的表面羥基磷灰石納米網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)作為BMP-2的荷載系統(tǒng)可以促進(jìn)BMSCs的體外成骨分化，表明HGCCS是具有潛在應(yīng)用

16、價(jià)值的骨組織工程支架材料。
　　 4.豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(PADM)-羥基磷灰石復(fù)合支架材料對(duì)大鼠顱骨臨界骨缺損修復(fù)性能的初步研究
　　 課題組前期首次利用PADM作為基礎(chǔ)材料體外構(gòu)建了具有二級(jí)三維多孔結(jié)構(gòu)的天然膠原-羥基磷灰石復(fù)合支架材料，并研究了其對(duì)大鼠下頜骨臨界骨缺損的修復(fù)性能。在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建了8mm大鼠顱骨臨界骨缺損模型用于評(píng)價(jià)PADM和PADM-HAp的成骨生物活性。修復(fù)5周后，Micro-CT分析