AGEs通過(guò)MAPK通路抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)2型糖尿病大鼠損傷血管的修復(fù).pdf

1、目的：探討在2型糖尿病大鼠模型中，AGEs對(duì)EPCs修復(fù)損傷血管能力的影響，并進(jìn)一步了解其通路機(jī)制。
　　方法：（1）將購(gòu)買(mǎi)的SD大鼠在高脂飼料喂養(yǎng)2周后，利用STZ腹腔注射建立實(shí)驗(yàn)型2型糖尿病大鼠模型。（2）利用PTCA球囊導(dǎo)管對(duì)頸動(dòng)脈進(jìn)行內(nèi)皮損傷，建立頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷模型。（3）從正常大鼠股骨和脛骨的骨髓中提取內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）進(jìn)行培養(yǎng)，2周后，對(duì)將要移植的內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)并分組，即：正常EPCs組，空載體干預(yù)的virus

2、EPCs組，RAGE shRNA慢病毒干預(yù)的shRNAEPCs組，ERK通路抑制劑（PD98059）處理的ERKEPCs組，P38通路抑制劑（SB203580）處理的P38EPCs組，JNK通路抑制劑（SP600125）處理的JNKEPCs組。（4）在進(jìn)行細(xì)胞移植前1周，將所有參與實(shí)驗(yàn)的大鼠進(jìn)行脾切除，防止移植的外源性EPCs歸巢于脾臟被破壞。（5）將大鼠分為正常組（N組），糖尿病+損傷組+EGM-2（對(duì)照組），糖尿病+損傷+普通EPC

3、s組（DM+I+EPCs），糖尿病+損傷+空載體組（DM+I+virusEPCs），糖尿病+損傷+RAGEshRNA組（DM+I+shRNAEPCs），糖尿病+損傷+ERK組（DM+I+ERKEPCs），糖尿病+損傷+P38組(DM+I+P38EPCs），糖尿病+損傷+JNK組（DM+I+JNKEPCs），在對(duì)大鼠進(jìn)行頸動(dòng)脈球囊損傷即刻，立即將各組EPCs以1X10^6/ml的濃度通過(guò)尾靜脈注射至大鼠體內(nèi)。（6）進(jìn)行移植后，分別在移植當(dāng)

4、天，7天，14天采用血糖儀測(cè)量每只大鼠的隨機(jī)血糖并記錄，第14天時(shí)用一次性采血針進(jìn)行心臟采血，隨后脫頸處死小鼠，并取左側(cè)頸動(dòng)脈行鈣化檢測(cè)及相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)。所采血液離心后取上清液，分裝于EP管中，保存于-20℃冰箱備用。（7）采用ELISA法測(cè)定各組大鼠血清AGEs的含量，對(duì)頸動(dòng)脈行鈣定量測(cè)定及ALP活性測(cè)定，并將部分頸動(dòng)脈做成石蠟切片，行馮庫(kù)薩染色。（8）利用蛋白印跡法測(cè)定頸動(dòng)脈OPG，BMP-2蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：（1）

5、與正常大鼠相比，糖尿病大鼠血清中AGEs含量明顯增加；（2）與正常大鼠相比，對(duì)照組大鼠頸動(dòng)脈鈣化明顯加重，鈣含量及ALP活性增加；（3）球囊損傷后的糖尿病大鼠進(jìn)行普通EPCs移植后，其頸動(dòng)脈鈣化程度與對(duì)照組相比，未見(jiàn)明顯差異，但在球囊損傷后的糖尿病大鼠進(jìn)行RAGE shRNA干預(yù)過(guò)的EPCs進(jìn)行移植后，其頸動(dòng)脈鈣化程度明顯降低。（4）球囊損傷后的糖尿病大鼠在進(jìn)行被ERK通路抑制劑處理過(guò)的EPCs移植以后，其頸動(dòng)脈鈣化程度與對(duì)照組相比，未