毛細(xì)管電泳-連續(xù)光多光子激發(fā)熒光檢測(cè)系統(tǒng)的研制和應(yīng)用研究.pdf

1、歷經(jīng)20 多年的發(fā)展，高靈敏、高分辨、高速度、低樣品消耗的微分離分析-毛細(xì)管電泳(Capillary Electrophoresis，CE)以其多元化的分離模式和多樣化的聯(lián)用探測(cè)方式，成為分離分析領(lǐng)域的一個(gè)強(qiáng)有力的研究手段，廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域，尤其在生命科學(xué)領(lǐng)域。多光子激發(fā)熒光(Multiphoton Excited Fluorescence，MPEF or MPE)擁有超高的空間分辨率(亞飛升水平)、高靈敏度(單分子)、深度穿透、較低光

2、毒性和光漂白等諸多優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。Shear 等首先將多光子激發(fā)熒光和毛細(xì)管電泳結(jié)合起來，即建立了全新的CE-MPEF分析系統(tǒng)，在zmol 水平探測(cè)了自發(fā)熒光生物分子和熒光標(biāo)記的神經(jīng)遞質(zhì)。由于其采用飛秒鎖模Ti:sapphire 激光器，價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜、維護(hù)和運(yùn)行成本高，限制了CE-MPEF的推廣和應(yīng)用。近年來，半導(dǎo)體激光器的制造技術(shù)發(fā)展迅速，近紅外波長(zhǎng)、大功率、長(zhǎng)壽命和小巧價(jià)廉的半導(dǎo)體激光器的出現(xiàn)，有望成為理想的熒光

3、激發(fā)光源。
　　 本論文采用半導(dǎo)體激光器作為多光子激發(fā)熒光的激發(fā)光源，建立一新型毛細(xì)管電泳-多光子激發(fā)熒光(CE-MPEF)檢測(cè)系統(tǒng)，并對(duì)CE-MPEF的探測(cè)模式進(jìn)行了改進(jìn)，進(jìn)而開展了相關(guān)的應(yīng)用研究。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　 (1)采用廉價(jià)的半導(dǎo)體激光器取代昂貴的Ti:Sapphire 飛秒激光器，構(gòu)建了以連續(xù)光(Continuous Wave Laser Diode，CW-LD)多光子激發(fā)熒光為檢測(cè)手段的毛細(xì)管電

4、泳系統(tǒng)(CW-LD CE-MPE)。采用本系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了以小分子熒光染料、量子點(diǎn)和熒光蛋白作為樣品的電泳分離和熒光檢測(cè)，并論證了檢測(cè)的熒光為多光子激發(fā)熒光；進(jìn)而在毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)和膠束電動(dòng)色譜(MEKC)兩種分離模式下，實(shí)現(xiàn)異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的多種氨基酸分子的分離和多光子激發(fā)熒光檢測(cè)；實(shí)驗(yàn)表明：
　　 LD作為CE-MPE系統(tǒng)的激發(fā)光源是可行的。
　　 (2)設(shè)計(jì)了一個(gè)適合CE-MPEF系統(tǒng)熒光檢測(cè)的檢測(cè)

5、器。比較了圓形和方形毛細(xì)管不同幾何規(guī)格對(duì)電泳分離效果的影響，設(shè)計(jì)了方形和圓形毛細(xì)管結(jié)合的柱上檢測(cè)器，并成功地用于本CE-MPEF系統(tǒng)的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)表明：方形和圓形毛細(xì)管結(jié)合的柱上檢測(cè)器即保留了圓形毛細(xì)管良好的電泳分離效果，又提高了多光子激發(fā)熒光探測(cè)靈敏度(檢測(cè)限提高了2～5 倍)。
　　 (3)采用CW-LD CE-MPEF系統(tǒng)，對(duì)比單光子激發(fā)熒光的LIF-CE系統(tǒng)，在MEKC分離模式下，對(duì)21種FITC 標(biāo)記的氨基酸進(jìn)行了電泳分

6、離和多光子激發(fā)熒光檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)證明：系統(tǒng)有較高的分離效率，完全實(shí)現(xiàn)21種FITC 標(biāo)記的氨基酸的基線分離；在定量分析的線性校正曲線區(qū)間(2個(gè)數(shù)量級(jí))，質(zhì)量檢測(cè)限(zmol)和濃度檢測(cè)限(μM)的基礎(chǔ)上，分析了八峰氨基酸口服液，檢測(cè)分析的氨基酸含量與廠家提供的數(shù)據(jù)基本一致(誤差＜5％)。
　　 (4)本系統(tǒng)成功地應(yīng)用于腐胺等6種生物胺標(biāo)樣分析和常溫保存的鮮魚腐液中胺類物質(zhì)分析。結(jié)果顯示，系統(tǒng)可以用于食品胺類檢測(cè)，為食品安全提供了一種

7、分離效率高、質(zhì)量檢測(cè)靈敏度高和低消耗，且適于復(fù)雜體系測(cè)量的分析手段。
　　 (5)采用本系統(tǒng)對(duì)持久性有機(jī)污染物(POPs)類環(huán)境惡性污染物，進(jìn)行了分析，在優(yōu)化了衍生條件和分離條件基礎(chǔ)上，對(duì)苯胺等4種POPs 物質(zhì)進(jìn)行了電泳分離和多光子激發(fā)熒光探測(cè)；并對(duì)東湖水水體POPs 類物質(zhì)進(jìn)行了分析，為環(huán)境POPs 物質(zhì)的監(jiān)控提供了新的分離和探測(cè)手段。
　　 (6)多光子激發(fā)熒光技術(shù)具有超寬的激發(fā)光譜，適合多標(biāo)記復(fù)合測(cè)量。例如，本C