新型毛細(xì)管電泳光學(xué)檢測(cè)器的研制及應(yīng)用研究.pdf

1、高效毛細(xì)管電泳（CE）是近年來(lái)發(fā)展最快的分離分析技術(shù)之一，由于該技術(shù)具有簡(jiǎn)單、高效、快速、微量、經(jīng)濟(jì)、清潔、易于自動(dòng)化和環(huán)境污染少等優(yōu)點(diǎn)，目前已在生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。由于CE溶質(zhì)區(qū)帶的超小體積導(dǎo)致光程太短，需要高靈敏度的檢測(cè)器與之匹配，因此檢測(cè)器的研制一直是CE技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題。目前已采用的檢測(cè)器主要有：紫外可見(jiàn)光吸收、激光誘導(dǎo)熒光、化學(xué)發(fā)光（CL）、質(zhì)譜、核磁共振和電化學(xué)檢測(cè)器等，其中激光誘導(dǎo)熒光和C

2、L是最靈敏的兩種檢測(cè)器。但常規(guī)的激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器，必須采用激光器作為激發(fā)光源，例如氬離子激光器和氦—鎘激光器，這些激光器不僅可供選擇的激發(fā)波長(zhǎng)有限，而且價(jià)格昂貴、體積龐大，使用壽命短，因而大大限制了CE激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)法的應(yīng)用。而對(duì)于CE－CL檢測(cè)，盡管已發(fā)展了多種類(lèi)型的檢測(cè)器，但目前的高靈敏檢測(cè)主要集中在無(wú)機(jī)離子的檢測(cè)方面，而用于檢測(cè)生物活性分子，其靈敏度一般都不高，在生物樣品分析中的應(yīng)用也較少。因此，研制通用性的高靈敏光學(xué)檢測(cè)器，

3、建立高靈敏CE分離分析方法，并應(yīng)用于生物樣品分析，對(duì)于推動(dòng)生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究的發(fā)展，具有重要的意義。 本研究工作旨在發(fā)展一些新的CE光學(xué)檢測(cè)器，建立生物體內(nèi)一些重要生物活性分了的高靈敏檢測(cè)方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣品分析，從而獲取一些有重要價(jià)值和理論意義的數(shù)據(jù)和新發(fā)現(xiàn)。為此主要開(kāi)展了以下三個(gè)方面的工作。 1.設(shè)計(jì)組裝了CE光導(dǎo)纖維發(fā)光二極管（LED）誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器，并建立相應(yīng)的CE分析系統(tǒng)。該系統(tǒng)以非常便宜的LED作為激發(fā)

4、光源，用光導(dǎo)纖維將光直接導(dǎo)入毛細(xì)管內(nèi)，在溶液中激發(fā)被測(cè)物質(zhì)產(chǎn)生熒光，避免了毛細(xì)管壁的散射和反射現(xiàn)象，因而具有較高的靈敏度。以萘二甲醛（NDA）標(biāo)記的氨基酸和熒光素異硫氰酸酯（FITC）標(biāo)記的氨基酸混合物為試驗(yàn)化合物，考察了該系統(tǒng)的分離和測(cè)試性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該系統(tǒng)具有良好分離效果，高的靈敏度，檢測(cè)限在10<'-8>～10<'-9>mol.L<'-1>之間，各種性能接近CE激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)。另外，由于在紫外和可見(jiàn)光范圍內(nèi)，各個(gè)波長(zhǎng)段均

5、可得到相應(yīng)的LED，因而與CE激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)相比，該檢測(cè)系統(tǒng)具有更加廣泛的應(yīng)用前景。利用該系統(tǒng)，已分別建立了生物樣品中胍基丁胺和D-天冬氨酸，D-谷氨酸的CE分析方法。并對(duì)大鼠大腦、大鼠胃及人血清、人尿液中的胍基丁胺的含量進(jìn)行了測(cè)定，首次測(cè)得人尿液中含有30～60ng/mL.的胍基丁胺。應(yīng)用于小鼠大腦中D-天冬氨酸和D-谷氨酸的含量測(cè)定時(shí)，對(duì)其注射神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1.2.3.6-四氫吡啶（MPTP），使其發(fā)生了帕金森疾

6、病癥狀后的小鼠大腦組織中，對(duì)D-Asp和D-Glu含量的變化情況進(jìn)行了考察。發(fā)現(xiàn)隨MPTP用藥時(shí)間的增長(zhǎng)，帕金森疾病的癥狀愈來(lái)愈明顯，其D-Asp和D-G1u含量亦明顯增高，用藥5天后含量達(dá)最大值。為生物醫(yī)學(xué)研究提供了有重要參考價(jià)值和理論意義的數(shù)據(jù)。 2.設(shè)計(jì)組裝了一套新的CE-CL檢測(cè)系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用四通式接口和套管式在線(xiàn)活動(dòng)檢測(cè)窗口，光電倍增管緊貼反應(yīng)毛細(xì)管的檢測(cè)窗，并在檢測(cè)窗口下放置一面反光鏡。因此檢測(cè)池密閉性能好，收集C

7、L的效率高。與現(xiàn)有大多數(shù)CL檢測(cè)器相比，測(cè)定氨基酸時(shí)的靈敏度提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。利用該系統(tǒng)，分別建立了生物樣品中葉酸，氨基酸和對(duì)乙酰氨基酚等物質(zhì)的測(cè)定方法，并已分別應(yīng)用于葉酸片劑、果汁和人尿液中葉酸含量的測(cè)定，人血清中14種氨基酸含量的測(cè)定，以及人尿液中對(duì)乙酰氨基酚含量的測(cè)定，并對(duì)對(duì)乙酰氨基酚的人體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究。采用CE-CL檢測(cè)技術(shù)測(cè)定上述物質(zhì)，靈敏度高，選擇性好，國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)有同類(lèi)工作報(bào)道。 3．組裝了一套CE激光誘

8、導(dǎo)熒光檢測(cè)系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)建立了大鼠大腦中D－絲氨酸含量的CE激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)方法。該方法以4－氟－7－硝基－2，1，3－苯并噫二唑（NBD-F）為衍生試劑，羥丙基－β－環(huán)糊精為手性選擇劑，對(duì)D/L-絲氨酸對(duì)映體的NBD-F衍生物，進(jìn)行了手性拆分研究，并對(duì)大鼠大腦中D-絲氨酸的含量進(jìn)行了檢測(cè)。測(cè)得大鼠大腦中D-絲氨酸含量在95～140nmol/g之間。另外，利用該系統(tǒng)建立了大鼠大腦中D/L-天冬氨酸含量的測(cè)定方法，并測(cè)定了在正常和腦缺血

9、情況下，大鼠大腦皮質(zhì)中D/L-天冬氨酸的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常情況下每克濕的大腦皮質(zhì)組織中，含142.8nmol L－天冬氨酸和49.1 nmol D－天冬氨酸，但在腦缺血情況下，L-天冬氨酸的含量快速升高，而D-天冬氨酸的含量反而降低。腦缺血30min時(shí)，L-天冬氨酸的含量為241.2nmol，升高了68.9％，D-天冬氨酸的含量為31.3nmol，降低了36.3％。這一結(jié)果表明，生理學(xué)中的興奮性氨基酸可能僅指L－氨基酸，而不包括它們