果蔬有機(jī)磷殘留農(nóng)藥降解酶菌種的選育及產(chǎn)酶條件的研究.pdf

1、隨著生活水平的提高，食品安全問題日益受到人們的關(guān)注，果蔬中農(nóng)藥的殘留對人體健康構(gòu)成威脅，為解決這一問題，可以通過微生物發(fā)酵的方法來降解農(nóng)藥。本文主要研究有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的篩選、菌株培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化、有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶的分離提純、酶學(xué)性質(zhì)研究及其基因研究。
　　利用96孔板法從長期噴灑農(nóng)藥的耕地土壤中篩選出能高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的菌株，并對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明:篩選的菌株為膠紅酵母菌（Rhodotorul

2、a mucilaginosa），命名為RM-DY21，利用紫外分光光度法測定菌株RM-DY21在32h內(nèi)對毒死蜱(50mg/L)降解率可達(dá)70.04％，在以毒死蜱為唯一碳源的培養(yǎng)基中，RM-DY21生長較好，氧樂果次之，敵百蟲中較少，故說明菌株RM-DY21可以廣泛降解有機(jī)磷農(nóng)藥。
　　為提高Rhodotorula mucilaginosa RM-DY21對有機(jī)磷農(nóng)藥的降解率，通過單因素及響應(yīng)曲面分析，對培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

3、實驗確定了Rhodotorula mucilaginosa RM-DY21最優(yōu)培養(yǎng)基配方為:乳糖20.0g/L，硫酸銨20.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，Ca2+、Mg2+、Zn2+的添加量分別為0.8、0.6、0.8mg/20mL發(fā)酵液;利用Design-expert8.0軟件進(jìn)行Box-Behnken中心組合設(shè)計原理分析實驗，確定初始pH5.0，溫度30℃，培養(yǎng)36h時，Rhodotorula mucilaginosa RM-D

4、Y21對有機(jī)磷農(nóng)藥的降解率可達(dá)到83.86％，比優(yōu)化前提高了10.62％，為后續(xù)菌株產(chǎn)酶研究的相關(guān)試驗奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　實驗對菌株Rhodotorula mucilaginosa RM-DY21所產(chǎn)有機(jī)磷降解酶進(jìn)行定位，并采用鹽析及柱層析的方法對有機(jī)磷降解酶進(jìn)行了分離純化。實驗結(jié)果表明，Rhodotorula mucilaginosa RM-DY21菌株所產(chǎn)生的有機(jī)磷降解酶為胞外酶;通過硫酸銨分級沉淀，得到降解酶鹽析范圍為6

5、0％～80％(w/v);透析并濃縮后，用Sephadex G-100葡聚糖凝膠進(jìn)行層析，得到有機(jī)磷降解酶的比酶活為350.63U/mg;再次透析濃縮后，用DEAESepharose Fast Flow柱層析，0.2～0.5mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，收集酶液測其比酶活為693.94U/mg;通過SDS-PAGE變性凝膠電泳確定Rhodotorula mucilaginosa RM-DY21所產(chǎn)的有機(jī)磷降解酶分子量約40kDa

6、。酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)磷降解酶的反應(yīng)溫度為30～50℃，其最適反應(yīng)溫度為40℃;保存溫度在-20℃下最佳;反應(yīng)pH為7～9，最適pH為8;最適反應(yīng)時間為30min;最適酶添加量為20μL。不同金屬離子對有機(jī)磷降解酶的活性有不同的影響，0.2mmol/L的Na+、Zn2+對降解酶有較強(qiáng)的激活作用，而Ca2+、Mg2+的激活作用較弱;同濃度Li+、K+、Mn2+、Ag+對降解酶有較強(qiáng)的抑制作用，而Cu2+、Fe3+、Fe2+抑制作用較弱;

7、異丙醇、丙酮對酶活性有抑制作用，乙醇隨著濃度的升高激活作用增加;高濃度的甲醇有微弱提高酶活作用，并測得其動力學(xué)參數(shù)Km=24.213μmol·L-1，Vmax=18.553μmol·(mg·min)-1。
　　參照GenBank中已收錄的有機(jī)磷降解酶基因序列，利用Vector NTI10軟件分析并設(shè)計了2對特異性引物，對實驗菌株的產(chǎn)有機(jī)磷降解酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序，并利用相應(yīng)軟件對其氨基酸序列進(jìn)行分析。測序結(jié)果顯示，實驗菌株的有

8、機(jī)磷降解酶基因序列與其他多種菌株的一致性較高，該opd基因含1155個核苷酸，編碼384個氨基酸，OPD蛋白的分子式為C1830H2944N530O540S11,分子量約為41363.39Da，為疏水性穩(wěn)定蛋白，等電點(diǎn)為9.05，總原子數(shù)為5855，存在信號肽，屬于分泌型蛋白，二級結(jié)構(gòu)具有α螺旋(Hh)38.54％，延伸鏈(Ee)19.53％，β折疊(Tt)8.33％，無規(guī)則卷曲(Cc)33.59％;此酶以2rl1.1.A（有機(jī)磷水解酶