有機(jī)磷農(nóng)藥甲基對(duì)硫磷降解菌的代謝途徑及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、有機(jī)磷農(nóng)藥（Organophosphate pesticides，OPs）是目前全世界廣泛使用的一類農(nóng)藥，是主要的農(nóng)藥污染源。由此所引發(fā)的環(huán)境污染嚴(yán)重威脅人畜生命安全，制約著經(jīng)濟(jì)和社會(huì)可持續(xù)發(fā)展。篩選高效廣譜的農(nóng)藥降解功能菌，通過環(huán)境微生物或微生物源酶制劑來消除有機(jī)磷農(nóng)藥污染具有效率高、成本低、降解徹底、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，是修復(fù)有機(jī)磷農(nóng)藥污染土壤的有效途徑之一，并已成為相關(guān)研究的熱點(diǎn)。本研究從長(zhǎng)期受有機(jī)磷農(nóng)藥污染的環(huán)境中分離得到兩株有機(jī)

2、磷農(nóng)藥高效降解菌，并對(duì)其降解特性、代謝途徑、分子機(jī)制和初步應(yīng)用等方面進(jìn)行了研究。 從湖北沙隆達(dá)農(nóng)藥廠廢水污泥和湖北黃岡市長(zhǎng)期施用有機(jī)磷農(nóng)藥的棉田土壤中取樣，分離得到兩株有機(jī)磷農(nóng)藥高效降解菌HS-D36和HS-D38。HS-D36能高效降解甲基對(duì)硫磷（Methyl parathion，MP），但對(duì)農(nóng)藥中間體對(duì)硝基苯酚（p-Nitrophenol，PNP）降解能力相對(duì)較弱；而HS-D38能高效降解高濃度對(duì)硝基苯酚，并以它作為唯一的

3、碳源和氮源生長(zhǎng)，但該菌只能部分降解甲基對(duì)硫磷。對(duì)兩株降解菌進(jìn)行了形態(tài)觀察和生理生化鑒定，結(jié)合16s rDNA分子水平鑒定，HS-D36鑒定為施氏假單胞菌屬（Pseudomonas stutzeri），HS-D38鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。研究表明，HS-D36能于3h內(nèi)對(duì)50 mg/L甲基對(duì)硫磷降解率達(dá)到90％，12h內(nèi)將50 mg/L對(duì)硝基苯酚完全降解；HS-D38能部分降解50 mg/L甲基

4、對(duì)硫磷，降解過程沒有對(duì)硝基苯酚的積累，并在12h內(nèi)將500 mg/L的高濃度對(duì)硝基苯酚完全降解。廣譜特性研究表明，HS-D36菌株24h內(nèi)對(duì)50 mg/L的毒死蜱和甲胺磷降解率達(dá)到80％以上，能部分降解辛硫磷、三唑磷和樂果：Hs-D38能降解50 mg/L乙酰甲胺磷、毒死蜱和樂果降解率達(dá)70％以上，對(duì)三唑磷和甲胺磷也有較強(qiáng)的降解能力，表現(xiàn)出較好的廣譜降解特性。兩菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥及其中間產(chǎn)物的高效降解鮮見報(bào)道。 以HS-D36基

5、因組DNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增并克隆了有機(jī)磷水解酶基因opd（長(zhǎng)為996bp，GenBank NΩ：EF515812）。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)，同源分析發(fā)現(xiàn)，opd基因與來自于甲基對(duì)硫磷降解菌Pseudomonas sp.WBC-3的mpd基因同源性高達(dá)99％。將opd基因亞克隆到高效表達(dá)載體pET-28a，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-opd，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21菌株中進(jìn)行原核表達(dá)。SDS-PAGE分析可見35kD處有

6、一強(qiáng)特異性條帶。通過超聲波裂解細(xì)胞，提取甲基對(duì)硫磷水解酶粗酶液，對(duì)酶學(xué)特性進(jìn)行了研究。OPD酶的最適作用溫度為30℃、最適pH值為10.0，金屬離子Zn2+、Cd2+、Fe3+、Cr2+、Co2+對(duì)酶活力有不同程度的激活效應(yīng)，Na+、Ni2+、Cu2+、K+、Mg2+則對(duì)其活性有抑制作用。 運(yùn)用生物信息學(xué)手段，對(duì)目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道的有機(jī)磷水解酶基因進(jìn)行了系統(tǒng)檢索和同源比對(duì)。結(jié)果表明，來自不同菌株的OPD、MPD、OPH和MPH

7、等都屬于有機(jī)磷水解酶家族。有機(jī)磷水解酶OPD與來自Pseudomonas sp.WBC-3的甲基對(duì)硫磷水解酶MPD（AAP06948.1）的同源性高達(dá)99.0％，而與來自于Flavobacterium sp.的對(duì)硫磷水解酶PTE（AAA24930.1）和來自于Escherichia coli K-12磷酸三酯酶PTE（AAA58176.1）的同源性都很低。OPD的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，在opd基因序列開放閱讀框中有四個(gè)保守區(qū)域，分別定位

8、于48-56，131-145，225-230，290-297之間，該區(qū)域中α-螺旋和β-折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)豐富。定位于137-145和225-230之間的氨基酸殘基所形成的結(jié)構(gòu)域與β-內(nèi)酰胺酶家族結(jié)構(gòu)域一致，表明OPD屬于β-內(nèi)酰胺酶家族。以MPD（PDBID：1P9E）為模板，對(duì)OPD酶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源模建分析。結(jié)果表明，OPD酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)由兩個(gè)獨(dú)立的同型單體組成，每個(gè)單體由兩個(gè)αβ/βα二聚體折疊而成，二聚體含金屬離子活性中心前體，金屬

9、離子中心附近的空穴代表底物結(jié)合位點(diǎn)。成熟的OPD酶由含二價(jià)金屬離子Zn2+和Cd2+的兩個(gè)同型單體緊密結(jié)合形成的金屬酶。 薄層色譜（TLC）結(jié)合光譜學(xué)（UV-vis Spectra）分析表明，HS-D36降解MP的第一步代謝主要中間產(chǎn)物為PNP。通過化學(xué)萃取HS-D38降解PNP的降解液中間產(chǎn)物，進(jìn)一步運(yùn)用GC和LC-ESI/MS等方法，確定了HS-D38對(duì)PNP降解的關(guān)鍵中間產(chǎn)物是對(duì)苯二酚（HQ）和1，2，4-苯三酚（1，2

10、，4-BT）等。底物利用實(shí)驗(yàn)表明，HS-D38能較好利用HQ和1，2，4-BT。上述結(jié)果表明HS-D38是經(jīng)過HQ途徑降解PNP。初步確定了HS-D36和HS-D38協(xié)同礦化MP的最終代謝途徑，即通過HS-D36降解MP生成PNP，而PNP在HS-D38的降解作用下，經(jīng)HQ途徑進(jìn)一步降解生成HQ，HQ經(jīng)羥化生成1，2，4-BT，并最終進(jìn)入TCA循環(huán)，礦化為無(wú)機(jī)小分子物質(zhì)。HQ轉(zhuǎn)化為1，2，4-BT在假單胞菌屬中首次發(fā)現(xiàn)和報(bào)道。

11、 外加碳源和氮源對(duì)菌株的降解實(shí)驗(yàn)表明，HS-D38在ANM培養(yǎng)基中，對(duì)PNP的降解速度明顯加快，而在ACM培養(yǎng)基中降解速度減慢。HS-D36降解MP和HS-D38降解PNP的反應(yīng)均符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，模擬結(jié)果與動(dòng)態(tài)掃描分析結(jié)果一致。而外加碳源和氮源對(duì)HS-D36降解MP都具有促進(jìn)作用。不同菌株對(duì)模擬農(nóng)藥廢水中COD的去除能力不同，投加混合菌群較投加單一菌株效果更理想，對(duì)COD的去除率高達(dá)73.0％，而添加一定量的碳源和氮源，混合菌株對(duì)模