結(jié)腸腺瘤息肉蛋白N端功能區(qū)對細胞纖毛生長的影響及機制研究.pdf

1、纖毛(Cilia)是一種突出于細胞表面主要由細胞微管組成的亞細胞結(jié)構(gòu)。它可以調(diào)節(jié)細胞運動，還可作為細胞感受器，介導多種信號通路（Wnt、Hedgehog和PDGFR等），參與調(diào)節(jié)細胞的生長分化等多種生命活動。纖毛的結(jié)構(gòu)和功能異常導致纖毛相關疾病的發(fā)生。結(jié)腸腺瘤息肉蛋白(Adenomatous polyposis coli，APC)是一個腫瘤抑制因子。APC突變與家族性結(jié)腸腺瘤息肉病(Familial adenomatous polypo

2、sis，F(xiàn)AP)和Gardner綜合征的發(fā)生有關。Gardner綜合征是FAP的一個變體，它的腸外病變被報道是與纖毛異常相關的疾病，而APC突變是其發(fā)病的分子基礎。但目前國內(nèi)外關于APC和纖毛之間的相關性及APC突變導致纖毛異常的機制尚不清楚。本研究分為三個部分：
　　第一部分：APC及其N端功能區(qū)對細胞纖毛生長的影響。分別利用westernblotting和免疫熒光技術(shù)檢測NIH3T3細胞中，APC在纖毛生長過程中的表達變化及其

3、在纖毛的定位情況。將含有APC，APC-N，APC-M和APC-C的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入NIH3T3細胞中，觀察它們對纖毛生長的影響;分別利用NIH3T3和MDCK細胞為模型，重點研究ACP N端的三個片段（APC-N1，ACP-N2和APC-N3）對細胞纖毛生長的影響。結(jié)果表明APC在NIH3T3細胞纖毛的生長過程中表達上調(diào)并且定位于纖毛的基體。APC的N端片段APC-N1，APC-N2和APC-N3（分別包含APC的氨基酸序列1-1018

4、，1019-2038和2039-2843）的表達不同程度的抑制纖毛組裝，其中APC-N2對纖毛形成的抑制影響最大，APC-N3和APC-N1次之。
　　第二部分：APC的N端功能區(qū)抑制纖毛生長的機制研究。在上述實驗中我們發(fā)現(xiàn)APC的N端片段抑制纖毛的形成，本實驗從以下幾方面對它們抑制纖毛形成的機制進行深入研究：⑴APC的N端功能區(qū)中的三個片段APC-N1，APC-N2和APC-N3過量表達對纖毛相關蛋白GSK-3β的影響；⑵APC

5、-N1，APC-N2和APC-N3在纖毛中的定位情況；⑶APC-N1，APC-N2和APC-N3過量表達對基體組成蛋白γ-tubulin和pericentrin的影響；⑷APC-N1，APC-N2和APC-N3過量表達對acetylated tubulin的影響;5，APC-N1，APC-N2和APC-N3過量表達對細胞周期進展的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①APC的N端片段通過激活PI3K/AKT信號通路，進而抑制GSK3β的活性，使得纖毛形成受

6、到抑制；②盡管APC的N端三個片段都抑制纖毛的形成，但是它們在纖毛基體中的定位是不同的:APC-N1定位于基體，而APC-N2和部分APC-N3不存在于基體；③APC-N2和APC-N3降低了細胞內(nèi)γ-tubulin的蛋白表達量，這可能導致纖毛受損；④過表達APC-N2降低細胞acetylated tubulin的表達，用抑制劑TSA處理后acetylated tubulin的表達量和纖毛生長率都上升，表明APC-N2通過影響微管蛋白的

7、乙?；种评w毛的形成；⑤APC的N端片段不是通過擾亂細胞周期進展來抑制纖毛形成。
　　第三部分：APC的N端功能區(qū)對纖毛相關信號通路Wnt，Hedgehog和PDGFR的影響。本部分實驗主要是通過western blotting檢測APC的N端三個片段的過量表達對纖毛相關信號通路Wnt，Hedgehog和PDGFR中重要組成成員蛋白表達水平的影響。結(jié)果表明APC的N端三個片段過量表達后，Wnt信號通路中β-catenin的表達升高