利什曼原蟲過氧化物酶的修飾及其多酶體系的研究.pdf

1、利什曼原蟲過氧化物酶(LmP)是一種以細(xì)胞色素C為底物需消耗H2O2的一種血紅素過氧化物酶。本課題從來源于Leishmania major strain Friedlin的LmP基因片段出發(fā)，構(gòu)建了多個(gè)含有LmP基因片段的表達(dá)載體。
　　首先是通過分子生物學(xué)操作，構(gòu)建了分別含有類彈性蛋白ELP標(biāo)簽和小泛素相關(guān)修飾蛋白SUMO標(biāo)簽的融合蛋白表達(dá)載體，探究了其性質(zhì)的變化。通過Ni-NTA金屬螯合層析法對(duì)含有組氨酸標(biāo)簽的三種蛋白完成了純

2、化工作，到達(dá)了理想的純度，含ELP標(biāo)簽的蛋白用ITC法純化兩到三次便可達(dá)到理想效果。再對(duì)蛋白進(jìn)行了圓二色譜和熒光光譜的表征，在加入H2O2后，結(jié)構(gòu)變化最小的是加了ELP標(biāo)簽的蛋白。再結(jié)合熒光光譜測(cè)出的Stern-Volmer方程KSV數(shù)值，用數(shù)字直接證明加了ELP標(biāo)簽的LmP蛋白結(jié)構(gòu)變化最小，說明ELP標(biāo)簽對(duì)LmP蛋白構(gòu)象有一定的穩(wěn)定作用。SUMO標(biāo)簽的作用還是它的本職功能，助溶。同樣條件表達(dá)純化的LmP-SUMO和LmP，前者濃度是后

3、者10倍，SUMO標(biāo)簽增溶效果強(qiáng)大。改造后的酶活并沒有受到負(fù)面影響，甚至催化速率有所提高。
　　高效多酶催化體系在生物領(lǐng)域被廣泛研究，深入研究及完善多酶催化體系具有很大的發(fā)展?jié)摿?。所以本文通過內(nèi)含肽介導(dǎo)融合LmP和D-氨基酸氧化酶，建立LmP-DAAO復(fù)合酶催化體系。實(shí)驗(yàn)證明，進(jìn)一步提高了DAAO的酶活，DAAO可用于生產(chǎn)頭孢菌素類抗生素，這對(duì)DAAO在工業(yè)上的應(yīng)用中具有一定的參考意義。最后，在體外直接混合LmP和5-羥甲基糠醛氧