MBF2家族鑒定及其成員MBF2-1參與絲素重鏈轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究.pdf

1、家蠶能成為重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，主要原因在于其可以分泌蠶絲。蠶絲是由家蠶高度特化的器官-絲腺合成分泌的。根據(jù)絲腺各區(qū)段的結(jié)構(gòu)形態(tài)不同，將絲腺分成前部、中部及后部絲腺。絲的兩大組成部分—絲素和絲膠，分別是由后部絲腺及中部絲腺合成。其中，絲素是蠶絲的主要組成部分，它由絲素重鏈蛋白、絲素輕鏈蛋白及 P25蛋白組成的多聚體蛋白。絲蛋白的表達(dá)不僅具有組織特異性，還具有明顯的時(shí)期特異性。絲蛋白在幼蟲(chóng)前幾個(gè)齡期合成少量絲蛋白，主要用于眠期時(shí)，將自己固定在蠶

2、座上，以便蛻皮。絲蛋白只有在幼蟲(chóng)最后一齡末期才被大量合成。先前研究表明，絲蛋白的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平，并且絲蛋白的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在每齡盛食期，在眠期則不再轉(zhuǎn)錄。雖然研究學(xué)者對(duì)絲腺高效的蛋白合成能力和基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了持續(xù)的研究，但是目前只有少量的絲蛋白轉(zhuǎn)錄因子被鑒定，絲蛋白的高效特異表達(dá)的調(diào)控機(jī)制仍待進(jìn)一步闡明。
　　多蛋白橋梁因子 MBF2最初在絲腺中被分離并證明作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)揮作用。劉慶信等人研究發(fā)現(xiàn) MBF2在絲腺中大量存

3、在，且在絲腺并呈現(xiàn)周期性表達(dá)。我們推測(cè) MBF2在絲腺中發(fā)揮著重要功能?；诩倚Q基因組數(shù)據(jù)庫(kù)這一信息平臺(tái)，對(duì) MBF2進(jìn)行了分析并對(duì)其在絲素重鏈基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用進(jìn)行了研究，研究結(jié)果如下：
　　1.家蠶MBF2家族基因的鑒定、表達(dá)分析及功能研究
　　以MBF2氨基酸序列為質(zhì)詢序列，采用BLASTP程序檢索家蠶9倍基因組數(shù)據(jù)庫(kù)及 NCBI庫(kù)，獲得了9個(gè)家族候選基因，并將其分別命名為 MBF2-1、-2、-3、-4、-5、-6

4、、-7、-8、-9。信息分析結(jié)果顯示，它們均有 EST數(shù)據(jù)，且有些基因在染色體上成簇分布。氨基酸序列預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示該家族基因編碼的氨基酸殘基數(shù)目范圍為109-118個(gè)，且在N端均有信號(hào)肽，表明該家族基因在合成過(guò)程中需跨膜，很可能為分泌型蛋白。序列比對(duì)結(jié)果顯示，家蠶 MBF2成員有較高的同源性，序列一致性高達(dá)41％。進(jìn)化分析結(jié)果顯示，該家族基因?yàn)槔ハx(chóng)特有的一類(lèi)基因，家蠶 MBF2-1、MBF2-2、MBF2-3及 MBF2-7在進(jìn)化樹(shù)中

5、聚成一簇，并且它們與黑脈金斑蝶及樗蠶蛾的MBF2有著較近的進(jìn)化關(guān)系。其他成員與參與免疫反應(yīng)的病原體響應(yīng)基因βREPAT聚成一簇，說(shuō)明該基因家族很可能參與家蠶的免疫反應(yīng)。
　　組織表達(dá)譜分析結(jié)果顯示該家族基因成員具有明顯的組織特異性，MBF2-1在絲腺及馬氏管中髙量表達(dá)，MBF2-5在中腸中髙量表達(dá)， MBF2-2、MBF2-3、MBF2-4、MBF2-6和MBF2-8在血液中髙量表達(dá)。而MBF2-7在脂肪體，精卵巢中較高的量的表達(dá)

6、。時(shí)期表達(dá)譜分析結(jié)果則顯示，該家族基因表達(dá)呈現(xiàn)明顯的時(shí)期特異性，有些在預(yù)蛹期及蛹期髙量表達(dá)如 MBF2-4、-6、-8和-9；而有些基因在蛹期的表達(dá)量較低但在幼蟲(chóng)期髙量表達(dá)，如 MBF2-2、MBF2-3、MBF2-5；而MBF2-1與上述基因均不同，在五齡期及預(yù)蛹期髙量表達(dá)；MBF2-7則各時(shí)期均有表達(dá)，但在眠期的表達(dá)量較低。幼蟲(chóng)期是家蠶攝取食物獲得能量的時(shí)期，而蛹期則是完成成蟲(chóng)組織器官的發(fā)生、形成、以及生殖細(xì)胞的發(fā)育、成熟的時(shí)期。絲

7、腺、中腸、血液和脂肪體等組織均是是家蠶物質(zhì)和能量代謝的主要組織，表達(dá)譜分析顯示 MBF2家族成員在這些組織及時(shí)期髙量表達(dá)，說(shuō)明這些基因在家蠶代謝及發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。
　　Bb攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MBF2-4、MBF2-7、MBF2-9在注射 Bb后1h被明顯的上調(diào)表達(dá)，然后在注射3h后下調(diào)；MBF2-8則在注射12h后才被上調(diào)表達(dá)然后恢復(fù)到正常水平；與上述基因相反，MBF2-2和 MBF2-3在注射 Bb后3h被明顯的下調(diào)了

8、，緊接著恢復(fù)到正常的表達(dá)水平。結(jié)果表明這些基因參與家蠶對(duì)Bb的免疫反應(yīng)。饑餓及恢復(fù)食桑實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MBF2-1、-4及-8在饑餓的條件下被下調(diào)表達(dá)，而當(dāng)恢復(fù)食桑后，基因開(kāi)始上調(diào)表達(dá)；而 MBF-2、-3、-6及-7則呈現(xiàn)出相反表達(dá)模式， MBF2-5及 MBF2-9的表達(dá)模式上來(lái)看，它們的表達(dá)同樣被影響，但是與其他基因相比，變化的比較遲緩。以上結(jié)果表明該家族基因與營(yíng)養(yǎng)代謝有著很緊密的關(guān)聯(lián)。
　　2. MBF2的原核表達(dá)及表達(dá)模式

9、分析
　　通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體并誘導(dǎo)表達(dá)純化MBF2蛋白，并制備了多克隆抗體并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。絲腺不同區(qū)段qPCR結(jié)果顯示， MBF2僅在后部絲腺發(fā)生轉(zhuǎn)錄。絲腺不同區(qū)段Western blot結(jié)果顯示，不僅在后部絲腺檢測(cè)到了MBF2蛋白的存在，在前部絲腺及中部絲腺也檢測(cè)了MBF2蛋白的存在。蠶絲免疫熒光結(jié)果顯示，MBF2蛋白定位在絲膠層，且繭的最外層含量最高。以上結(jié)果表明該蛋白是一個(gè)分泌型蛋白,這與前面的預(yù)測(cè)是一致的。MBF2家族成

10、員MBF2-8已經(jīng)被證明可以參與家蠶的免疫反應(yīng)，說(shuō)明繭中的MBF2很可能發(fā)揮抵御外來(lái)病原入侵的作用，這對(duì)以后研究MBF2在免疫方面的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　對(duì)MBF2在后部絲腺的表達(dá)時(shí)期進(jìn)行Western blot及qPCR分析，結(jié)果顯示MBF2僅在后部絲腺發(fā)生轉(zhuǎn)錄，在四齡眠期髙量表達(dá)，在五齡前期也有較髙量的表達(dá)，而在五齡后期及上蔟其基本不表達(dá)。MBF2呈現(xiàn)出與fibH相反的表達(dá)模式，暗示MBF2可能參與絲素重鏈基因的轉(zhuǎn)錄。

11、　　3. MBF2基因參與fibH的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
　　為了檢測(cè)MBF2是否參與fibH的調(diào)控，我們采用了雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)，首先，構(gòu)建了MBF2細(xì)胞過(guò)表達(dá)載體及fibH的螢火蟲(chóng)螢光素酶報(bào)告載體，將它們轉(zhuǎn)入BmE細(xì)胞，并進(jìn)行了酶活測(cè)定。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)MBF2可以影響fibH啟動(dòng)子的活性。然而對(duì)MBF2的氨基酸序列分析，沒(méi)有預(yù)測(cè)到可以與DNA結(jié)合的功能域。那么MBF2很可能通過(guò)與其他的轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)控fibH的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)亞細(xì)胞定位，

12、我們發(fā)現(xiàn)MBF2與Bmdimm共定位于細(xì)胞核。為進(jìn)一步確定它們之間的關(guān)系，通過(guò)利用體外原核表達(dá)重組蛋白進(jìn)行Far-western實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，MBF2在體外可以與Bmdimm相互作用。此外，在家蠶BmE細(xì)胞系中進(jìn)行BiFC實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，MBF2與Bmdimm可以相互作用。以上結(jié)果表明MBF2可以與Bmdimm相互作用。有意思的是，Bmdimm已經(jīng)證明參與絲素重鏈調(diào)控且對(duì)絲素重鏈起到正調(diào)控的作用，但是，當(dāng)我們同時(shí)過(guò)表達(dá)MBF2和Bmd

13、imm時(shí)，fibH啟動(dòng)子的活性下調(diào)。結(jié)果表明MBF2可以抑制Bmdimm對(duì)fibH的調(diào)控作用并下調(diào)fibH啟動(dòng)子的活性。
　　4. FTZ-F1參與fibH轉(zhuǎn)錄調(diào)控
　　已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道 MBF2可以參與 FTZ-F1對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，但是兩者之間是否存在直接的相互作用關(guān)系尚未得知。我們首先原核表達(dá)，純化FTZ-F1蛋白并制備抗體。qPCR及Western blot分析結(jié)果顯示，F(xiàn)TZ-F1在五齡三天的各組織中均有表達(dá)。其

14、中，五齡三天各組織Western blot結(jié)果顯示FTZ-F1在絲腺、馬氏管中的表達(dá)量較高。時(shí)期表達(dá)譜分析結(jié)果顯示，F(xiàn)TZ-F1在眠期的后部絲腺表達(dá)量最高，五齡期以后表達(dá)量逐漸降低，在五齡末期及上蔟期基本不表達(dá)，這種表達(dá)模式與 MBF2表達(dá)模式一致，而與 fibH表達(dá)模式相反。亞細(xì)胞定位、Co-IP、BiFC及 Far-western等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 FTZ-F1與MBF2可以相互作用。我們已經(jīng)證明了MBF2可以參與fibH的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。那

15、么FTZ-F1是否也參與fibH的轉(zhuǎn)錄調(diào)控呢？
　　我們對(duì) fibH啟動(dòng)子進(jìn)行了分析，分析結(jié)果顯示，在 fibH啟動(dòng)子的-389~-397及-652~-659處存在FTZ-F1潛在的結(jié)合位點(diǎn)。EMSA及ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FTZ-F1可以與 fibH（-389~-397）位點(diǎn)結(jié)合。當(dāng)我們將啟動(dòng)子該位點(diǎn)突變或是截短時(shí)，fibH啟動(dòng)子的活性上調(diào)。為了對(duì)這一點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)，將該位點(diǎn)突變后的fibH啟動(dòng)子螢光素酶報(bào)告載體與 FTZ-F1

16、過(guò)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)進(jìn)行酶活檢測(cè)，結(jié)果顯示，對(duì) fibH啟動(dòng)子活性沒(méi)有顯著性變化。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示家蠶FTZ-F1通過(guò)結(jié)合該位點(diǎn)調(diào)控fibH啟動(dòng)子活性。
　　我們已經(jīng)證明單獨(dú)過(guò)表達(dá)MBF2或FTZ-F1均可以下調(diào)fibH的啟動(dòng)子的活性，并且它們存在相互作用。為了研究?jī)烧呤欠窨梢砸黄鹱饔谜{(diào)控fibH，我們將MBF2及FTZ-F1同時(shí)過(guò)表達(dá)，結(jié)果顯示，fibH啟動(dòng)子的活性下調(diào)更加顯著。結(jié)果說(shuō)明MBF2與FTZ-F1相互作用并參與fibH的轉(zhuǎn)

17、錄調(diào)控作用。qPCR分析FTZ-F1及MBF2在大造及高絲量的品種872中后部絲腺的表達(dá)量，結(jié)果顯示MBF2及FTZ-F1在872中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于大造中的表達(dá)量。
　　有趣的是，對(duì)fibH啟動(dòng)子進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)fibH啟動(dòng)子上FTZ-F1與Bmdimm的結(jié)合位點(diǎn)靠的很近，我們已經(jīng)證明它們均與MBF2相互作用。那么它們之間是否存在相互作用呢？我們對(duì)此進(jìn)行了研究。BiFC及Far-western實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)TZ-F1可以與Bmdi

18、mm相互作用。雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示，單獨(dú)過(guò)表達(dá)Bmdimm時(shí)， fibH啟動(dòng)子活性上調(diào)。當(dāng)將FTZ-F1與Bmdimm共表達(dá)時(shí)， fibH啟動(dòng)子的活性無(wú)明顯變化。結(jié)果表明BmFTZ-F1可以抑制Bmdimm對(duì)fibH啟動(dòng)子活性的上調(diào)作用。
　　5.蛻皮激素對(duì)fibH調(diào)控的影響
　　到目前為止，關(guān)于蛻皮激素調(diào)控家蠶fibH的報(bào)道比較少。為了研究蛻皮激素對(duì)家蠶fibH轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響，我們將fibH啟動(dòng)子的螢光素酶報(bào)告載體轉(zhuǎn)

19、入細(xì)胞，然后用蛻皮激素處理細(xì)胞，酶活檢測(cè)結(jié)果顯示，20E可以調(diào)控fibH啟動(dòng)子活性，并呈現(xiàn)出劑量依賴性的影響。那么20E是怎么實(shí)現(xiàn)對(duì)fibH調(diào)控的呢？
　　已經(jīng)有文章報(bào)道，無(wú)論在體內(nèi)還是在體外，當(dāng)用20E處理后部絲腺時(shí)均可以誘導(dǎo)FTZ-F1的表達(dá)。MBF2與FTZ-F1在后部絲腺中有著相似的表達(dá)模式。那么MBF2是否受蛻皮激素調(diào)控呢？我們對(duì)MBF2啟動(dòng)子進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，分析結(jié)果顯示，在MBF2啟動(dòng)子上游有BrC、EcR、E74A等

20、多個(gè)核激素受體的作用元件。蛻皮激素的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無(wú)論是在體內(nèi)還是體外，MBF2均被20E上調(diào)表達(dá)，我們還發(fā)現(xiàn)當(dāng)MBF2被上調(diào)表達(dá)時(shí)，fibH的表達(dá)量卻下調(diào)了。該結(jié)果說(shuō)明20E很可能通過(guò)調(diào)控MBF2參與fibH的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。我們已經(jīng)證明MBF2可以與FTZ-F1相互作用并參與fibH的調(diào)控。有文獻(xiàn)報(bào)道20E可以誘導(dǎo)后部絲腺內(nèi)FTZ-F1的表達(dá)。綜合以上結(jié)果表明蛻皮激素可以通過(guò)MBF2及FTZ-F1介導(dǎo)調(diào)控fibH的轉(zhuǎn)錄。
　　綜