大黃素對胃癌PRL-3表達與下游AKT、Bcl-2家族調(diào)控作用及機理研究.pdf

1、目的和意義:
　　 胃癌是占世界高發(fā)腫瘤的第二位，占我國高發(fā)性消化道腫瘤的第一位，且發(fā)生率呈逐年上升的趨勢，已成為威脅人類健康的主要殺手。單一的治療方法往往難以取得好的療效。如何針對患病個體實施綜合性的治療策略，一直為廣大腫瘤研究學(xué)者所關(guān)注。
　　 中藥治療腫瘤，具有療效確切、副作用少，有著其它治療方法無可比擬的優(yōu)勢。隨著當(dāng)代醫(yī)學(xué)特別是醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)的進展，抑癌中藥抗腫瘤的分子機制逐漸被一一揭示，這使中藥的現(xiàn)代化及世界化

2、成為可能。我國的藥用植物資源豐富，中藥的抗腫瘤活性已得到國際所公認(rèn)。據(jù)統(tǒng)計，我國當(dāng)前已對藥用植物中28個科（屬），3000多種以上中草藥進行了抗癌篩選，其中含有抗癌活性成分的中草藥約有200種左右。
　　 常見抑癌中藥種類有清熱解毒類中藥、活血化瘀類中藥、軟堅散結(jié)類中藥、化濕利水類、扶正類中藥等。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)常見抑癌機制有:(1)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;(2)抑制腫瘤血管的生成;(3)調(diào)控癌基因的表達;(4)提高機體免疫功能，下調(diào)免疫

3、抑制分子并影響其免疫抑制效應(yīng)的發(fā)揮;(5)逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥性等。依據(jù)抑癌中藥的作用機制及作用靶點，有的放夭的去治療腫瘤，也為腫瘤的治療開拓了新的思路。
　　 大黃素（1'3'8-三羥基-6-甲基蒽醌），是蓼科植物虎杖的干燥根莖和根。其除了具有抗菌、止咳、降血壓作用外，還有著抗腫瘤作用。但其抗腫瘤機制研究不夠深入。我們研究了大黃素對人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞株細(xì)胞抑制及凋亡、PRL-3癌基因表達調(diào)控的影響;WangH等人通過研

4、究發(fā)現(xiàn)，PRL-3可以作為PI3K/AKT通路的上游調(diào)節(jié)分子，并在腫瘤轉(zhuǎn)移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要的作用。我們繼續(xù)探討了大黃素對胃腺癌SGC-7901細(xì)胞PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響，分析了其發(fā)揮抑癌作用的可能分子機制。
　　 方法:
　　 1、取對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，以5×105/ml接種于96孔培養(yǎng)板。細(xì)胞貼壁后，更換含大黃素培養(yǎng)基，使得實驗組含不同濃度大黃素，對照組加等量培養(yǎng)基，內(nèi)含

5、與最高濃度組等量的DMSO;每個濃度設(shè)8個復(fù)孔。置5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24、48、72h后，每孔加入20μl濃度為5mg/ml的MTT。繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄全部上清夜，每孔加DMSO200μl，37℃震蕩孵育10min。用酶標(biāo)儀檢測A570nm的OD值，計算細(xì)胞存活率及大黃素對細(xì)胞增殖的抑制率，實驗重復(fù)3次。
　　 2、將不同濃度的大黃素作用于體外培養(yǎng)的SGC-7901細(xì)胞24小時后，胰蛋白酶消化，PBS離心洗滌收集，稀釋至1

6、06/ml，以PBS重懸細(xì)胞，與適當(dāng)比例的吖啶橙/溴化乙啶熒光染液混合，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)并分別計數(shù)早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞、非凋亡的壞死細(xì)胞、活細(xì)胞，統(tǒng)計腫瘤細(xì)胞的凋亡率。
　　 3、將不同濃度的大黃素作用于體外培養(yǎng)的SGC-7901細(xì)胞24小時后，胰蛋白酶消化，調(diào)整待側(cè)細(xì)胞的密度為5×105-1×106個/ml，PBS洗滌，將細(xì)胞重懸于200μl結(jié)合緩沖液，加入適當(dāng)比例的Annexin-V-FITC和PI，混勻

7、室溫反應(yīng)15min后流式細(xì)胞儀檢測早期凋亡細(xì)胞率。
　　 4、利用實時熒光定量PCR儀，分析52例胃癌患者腫瘤組織及配對癌旁組織標(biāo)本中的PRL-3mRNA表達情況，了解PRL-3mRNA在胃癌腫瘤組織及癌旁組織中的表達差異。
　　 5、利用免疫印跡技術(shù)，分析52例胃癌患者腫瘤組織及配對癌旁組織標(biāo)本中的PRL-3蛋白表達情況，了解PRL-3蛋白在胃癌腫瘤組織及癌旁組織中的表達差異是否與mRNA一致。
　　 6、通過

8、實時熒光定量PCR分析及免疫組化方法，從轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平檢測PRL-3、Bmi-1在胃癌中的表達，了解其表達水平與臨床病理特征的關(guān)系，分析其臨床意義;
　　 7、大黃素作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞24h后，收集細(xì)胞，分別提取RNA及細(xì)胞內(nèi)總蛋白，檢測大黃素作用前后PRL-3mRNA及蛋白水平的變化，分析大黃素對PRL-3表達調(diào)控的影響;
　　 8、分析大黃素作用于胃癌SGC-7901細(xì)胞24h后，PI3K/AKT通路

9、相關(guān)蛋白及其下游分子表達的變化，探討大黃素的可能抗腫瘤機制。
　　 結(jié)果:
　　 1、MTT法檢測大黃素抑制SGC-7901增殖的實驗結(jié)果顯示:大黃素抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖呈時間、濃度依賴性。不同濃度大黃素作用于胃癌細(xì)胞24、48、72小時后，與對照組相比，細(xì)胞生存率顯著降低（P＜0.01）;除30μM濃度組與45μM濃度組在24小時段相比P＜0.05外，其余組間差異明顯(P＜0.01)。各濃度大黃素組隨著作

10、用時間的延長，細(xì)胞生存率也顯著性下降，組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2、通過AO-EB染色法在熒光顯微鏡下觀察大黃素作用于SGC-7901細(xì)胞，結(jié)果表明:作用24小時后對照組及15μM、30μM、45μM、60μM大黃素組的細(xì)胞凋亡率(％)分別為4.05±1.06、14.79±1.23、27.84±3.30、35.15±2.59、43.63±2.33;與對照組相比，統(tǒng)計學(xué)差異有顯著性（P＜0.01）。
　　

11、 3、流式細(xì)胞儀Annexin-V-FITC法檢測不同濃度的大黃素作用于SGC-7901細(xì)胞，結(jié)果表明:作用24小時后對照組及15μM、30μM、45μM、60μM大黃素組的早期凋亡細(xì)胞率(％)分別為3.52±1.05、11.63±1.54、23.58±3.14、30.45±2.96、37.25±2.06;實驗組與對照組相比，統(tǒng)計學(xué)差異有顯著性(P＜0.01)。
　　 4、52例胃癌及配對癌旁組織均可檢出PRL-3mRNA的表

12、達，胃癌腫瘤組織中PRL-3mRNA的相對表達量為2.57％±2.31％，癌旁組織中PRL-3mRNA的相對表達量為0.53％±0.42％，兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 5、胃癌腫瘤組織中PRL-3蛋白表達相對于內(nèi)參照的比值為0.79±0.12，癌旁組織中PRL-3蛋白表達相對于內(nèi)參照的比值為0.28±0.05，兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 6、PRL-3及Bmi-1mRNA相對表

13、達水平在腫瘤≥5cm的胃癌組織中均高于＜5cm的胃癌組織;在Ⅲ+Ⅳ期的胃癌組織中均高于Ⅰ+Ⅱ期的胃癌組織;在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織;在浸潤至胃壁漿膜層或漿膜層以外的腫瘤組織中均高于漿膜層以下浸潤的胃癌組織;但與患者的性別、年齡無關(guān)(P＞0.05)。另外PRL-3mRNA相對表達水平在低分化胃癌組織中高于中、高分化胃癌組織(P＜0.01)，而Bmi-1mRNA沒有表達差異(P＞0.05)。腫瘤組織中PRL-3

14、mRNA與Bmi-1mRNA的表達呈正相關(guān)(r=0.653，P＜0.05)。
　　 7.胃癌組織的PRL-3及Bmi-1表達陽性染色位于細(xì)胞膜/漿，呈棕色或棕褐色沉淀，點片狀分布，細(xì)胞核無染色。PRL-3蛋白在胃癌的表達與性別、年齡、腫瘤大小和分化程度均無相關(guān)性(P＞0.05），與胃癌的TNM分期有相關(guān)性(P＜0.05），與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性(P＜0.01）。Bmi-1蛋白在胃癌的表達與性別、年齡和分化程度均無相關(guān)

15、性(P＞0.05)，與胃癌的TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性(P＜0.05），與腫瘤大小有顯著相關(guān)性（P＜0.01）。
　　 8、大黃素作用組可以下調(diào)PRL-3mRNA表達，與對照組相比，15μM大黃素組下調(diào)率為32.47％，60μM大黃素組下調(diào)率為87.72％，在15-60μM范圍內(nèi)呈濃度相關(guān)性，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 9、PRL-3在人胃癌細(xì)胞系有表達，且不同濃度的大黃素作用細(xì)胞后，

16、隨著藥物濃度的增加，PRL-3蛋白表達不同水平的下調(diào)，與對照組相比有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 10、大黃素可以下調(diào)pAKT(Thr308)及pAKT(Ser473)蛋白表達水平，與對照組相比，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);而總AKT蛋白表達水平無明顯變化。
　　 11、與對照組比較，不同濃度的大黃素作用于細(xì)胞后，隨著藥物濃度的增加，與對照組比較Bax蛋白表達均有不同水平的上調(diào)，Bcl-2蛋白表達均有不同水平的下

17、調(diào)，Bax/Bcl-2比率逐漸增高，其中30μM、45μM、60μM大黃素組與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論:
　　 1、大黃素對SGC-7901細(xì)胞體外增殖有抑制作用，并呈時間、濃度依賴性;大黃素體外可以誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞的凋亡，提示大黃素抑制胃癌細(xì)胞生長的作用可能是通過促進胃癌細(xì)胞的凋亡而實現(xiàn)的;
　　 2、PRL-3mRNA及其蛋白在胃癌腫瘤組織中的表達均高于配對癌旁組織中的表達，提示PRL-3

18、與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切聯(lián)系;PRL-3的高表達與胃癌的侵襲和發(fā)展相關(guān);
　　 3、PRL-3在胃癌中表達水平的分析及其與Bmi-1聯(lián)合檢測可作為早期診斷胃癌、評估胃癌發(fā)展、了解胃癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后的分子水平參考指標(biāo);
　　 4、大黃素在抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖、促進胃癌細(xì)胞凋亡過程中，PRL-3mRNA及蛋白水平表達下降，提示該基因的表達調(diào)控可能為大黃素抗腫瘤的作用靶點之一。
　　 5、大黃素調(diào)控PI3K/AKT信