小鼠卵巢氧化應(yīng)激模型建立以及卵巢保護(hù)性抗氧化劑的篩選.pdf

1、隨著生活節(jié)奏的日益加快，社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)的日益激烈，無(wú)論是學(xué)習(xí)還是工作都處于緊張狀態(tài)，過(guò)度的緊張和焦慮導(dǎo)致現(xiàn)代職業(yè)女性的心理壓力越來(lái)越大，生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)病率越來(lái)越多，卵巢氧化應(yīng)激引起的人類生殖疾病也日益升高。卵巢氧化應(yīng)激不僅影響著卵子的生成、卵泡的發(fā)育、卵子的成熟、卵泡的閉鎖和排卵等，還能降低卵母細(xì)胞和胚胎的質(zhì)量以及影響早期胚胎的發(fā)育能力，這些都會(huì)使受精率、胚胎質(zhì)量、妊娠率顯著降低。由于倫理和道德等原因，很難在人類對(duì)卵巢氧化應(yīng)激的發(fā)生、發(fā)展和

2、治療進(jìn)行深入細(xì)致的研究。因此建立成功可靠的動(dòng)物卵巢氧化應(yīng)激模型，用于揭示卵巢氧化應(yīng)激機(jī)制以及開發(fā)研究新型抗卵巢氧化應(yīng)激藥物具有重要的實(shí)際意義。本研究應(yīng)用氧化劑3-NPA成功建立了小鼠卵巢氧化應(yīng)激模型，并對(duì)此模型進(jìn)行了評(píng)估。利用建立的小鼠卵巢氧化應(yīng)激模型，研究比較了10種不同抗氧化劑對(duì)卵巢氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，共篩選出了4種效果顯著的卵巢保護(hù)性抗氧化劑，這對(duì)于研究卵巢氧化應(yīng)激機(jī)制以及研究抗卵巢氧化應(yīng)激藥物的作用機(jī)制有著重要意義。
　　

3、1、利用3-NPA建立小鼠卵巢氧化應(yīng)激模型的研究
　　本試驗(yàn)通過(guò)觀察ICR雌性小鼠體內(nèi)注射不同濃度氧化劑3-NPA(6.25，12.5和25mg/kg)后，卵巢組織中ROS水平，抗氧化酶活性、各級(jí)卵泡數(shù)量、排卵數(shù)及早期胚胎發(fā)育等指標(biāo)來(lái)判斷卵巢氧化損傷的情況。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比較，小鼠腹腔內(nèi)注射3-NPA(12.5mg/kg)連續(xù)7天，不僅能顯著提高小鼠大卵泡閉鎖比例，降低卵巢重量和大卵泡數(shù)量(P＜0.05)，還能顯著降低小鼠排

4、卵數(shù)量和早期胚胎發(fā)育能力(P＜0.05)。除上述指標(biāo)外，3-NPA(12.5mg/kg)還能顯著降低顆粒細(xì)胞中Bcl-2/Bax的比值，提高(SOD2、CAT、GPX)mRNA的表達(dá)和ROS的水平（P＜0.05）。結(jié)果表明，小鼠腹腔內(nèi)注射3-NPA(12.5mg/kg)連續(xù)7天，可誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，大卵泡閉鎖和提高卵巢中ROS的水平。3-NPA所誘導(dǎo)的小鼠卵巢氧化應(yīng)激的損傷可作為卵巢氧化應(yīng)激的動(dòng)物模型。
　　2、卵巢氧化應(yīng)激保

5、護(hù)性抗氧化劑的篩選
　　本研究通過(guò)使用所建立的小鼠卵巢氧化應(yīng)激模型，研究比較了不同抗氧化劑對(duì)體內(nèi)卵巢氧化應(yīng)激的抗氧化保護(hù)作用。通過(guò)對(duì)10種不同抗氧化劑:VC、VE、胡蘿卜素、谷胱甘肽、沒食子酸、姜黃素、原花青素、白藜蘆醇、L-半胱氨酸和輔酶Q，抗氧化活性的檢測(cè)，我們將組織中的ROS水平和抗氧化物酶(SOD、CAT、GPX)的活性作為抗氧化功能的測(cè)定指標(biāo)。結(jié)果表明，L-半胱氨酸、沒食子酸、姜黃素、原花青素、白藜蘆醇和胡蘿卜素6種抗氧

6、化劑能夠顯著降低卵巢組織內(nèi)ROS的水平（P＜0.05）;其中姜黃素、原花青素、白藜蘆醇和胡蘿卜素4種抗氧化劑可顯著提高卵巢的重量（P＜0.05）。GSH、VE、L-半胱氨酸、沒食子酸、VC、輔酶Q、白藜蘆醇、胡蘿卜素8種抗氧化劑均可使卵巢組織中代償升高的GPX活性顯著下降（P＜0.05）。GSH、VE、L-半胱氨酸、姜黃素、VC、輔酶Q、白藜蘆醇、胡蘿卜素8種抗氧化劑均可使卵巢組織中代償升高的T-SOD明顯降低（P＜0.05）。GSH、

7、VE、原花青素、輔酶Q、胡蘿卜素5種抗氧化劑均能夠降低卵巢中代償升高的CAT活性（P＜0.05）。本研究表明，卵巢氧化應(yīng)激能夠?qū)е侣殉步M織的過(guò)氧化損傷，從而促進(jìn)卵巢相關(guān)疾病的發(fā)生，體內(nèi)補(bǔ)充抗氧化劑能夠顯著降低卵巢過(guò)氧化損傷和提高卵巢組織的抗氧化功能。
　　3、不同抗氧化劑體外抗氧化活性的比較研究
　　本研究以體外培養(yǎng)的小鼠卵巢顆粒細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察不同抗氧化劑:原花青素(PC)、維生素C(VC)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)

8、對(duì)3-NPA致小鼠卵泡顆粒細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。本研究共分為5組:陰性對(duì)照組、3-NPA模型組、PC組（50μg、100μg、200μg/mL）、VC組（25μg、50μg、100μg/mL）和NAC組（25μg、50μg、100μg/mL）。采用體外培養(yǎng)的方法，建立3-NPA致小鼠顆粒細(xì)胞氧化損傷模型。觀察各組細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu);采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞存活率，化學(xué)比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性;TUNEL

9、法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，RT-PCR法分析了抗應(yīng)激基因和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，高濃度的PC、VC、NAC均可減輕3-NPA誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞氧化損傷，與3-NPA組相比較，PC、VC、NAC組細(xì)胞存活率由53.7％分別上升到85.3％、63.8％和60.5％（P＜0.05）;細(xì)胞凋亡率由38.2％分別降低到13.4％、23.6％和25.8％（P＜0.05）;PC、VC、NAC組細(xì)胞內(nèi)SOD活性明顯降低(P＜0.05)，PC和VC組細(xì)胞

10、內(nèi)MDA含量顯著降低（P＜0.05）;PC、VC、NAC組細(xì)胞內(nèi)抗應(yīng)激和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論:PC和VC對(duì)3-NPA誘導(dǎo)的卵泡顆粒細(xì)胞的氧化損傷有顯著的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與提高顆粒細(xì)胞的抗氧化能力以及降低凋亡率有關(guān)。
　　4、小鼠卵巢氧化應(yīng)激對(duì)繁殖性能的影響
　　為了研究卵巢氧化應(yīng)激對(duì)孕鼠胚胎發(fā)育的影響，本研究利用以建立的小鼠卵巢氧化應(yīng)激模型為研究對(duì)象，在超數(shù)排卵處理后，雌雄小鼠合籠，于次日

11、早晨檢查陰道栓。孕鼠分別在孕齡7.5d、12.5d和18d頸椎脫臼處死，處死前分別稱重，然后剖腹取出子宮，分離出子宮內(nèi)胚胎，分別稱重，計(jì)數(shù)胚胎數(shù)量。結(jié)果表明，和對(duì)照組（生理鹽水）相比較，3-NPA誘導(dǎo)的卵巢氧化應(yīng)激組顯著地降低了孕鼠體重和增重;提高了胚胎的死亡率;降低了胎仔數(shù)量和胎鼠重量。結(jié)論:小鼠卵巢氧化應(yīng)激能夠顯著地降低受孕率和繁殖性能。
　　本研究利用氧化劑3-NPA成功地建立了小鼠卵巢氧化應(yīng)激模型，并且具有卵巢氧化應(yīng)激的典