抗氧化劑在梗阻性黃疸大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化應激損傷中的應用研究.pdf

1、背景:梗阻性黃疸是指肝內膽管或肝外膽管等膽道系統(tǒng)發(fā)生機械性梗阻時，膽紅素因膽汁向腸道的排泄受阻而返流入血所引起的黃疸。地卓西平馬來酸鹽（dizocilpinemaleate，MK-801）是一種非競爭性NMDA受體拮抗劑，大量研究結果證實MK-801對中毒、缺血缺氧、肝性腦病等多種情況下的神經(jīng)元損傷具有保護作用。
　　白藜蘆醇(resveratrol，Res)是在葡萄和紅酒中大量存在的一種黃酮類多酚化合物，大量的體內和體外研究發(fā)現(xiàn)

2、它有廣泛的生物學效應和藥學活性作用，如抵御活性自由基對機體細胞DNA的損傷并且防止細胞膜發(fā)生脂質過氧化反應等，并且已在心血管疾病、糖尿病、腎臟疾病等證實，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇所產生的藥理作用至少有部分是通過誘導HO-1的表達而發(fā)揮抗氧化應激損傷而進一步產生細胞保護作用的。
　　本實驗首先建立梗阻性黃疸大鼠模型，再通過觀察MK-801對梗阻性黃疸引起的大腦氧化應激反應中丙二醛(MDA)，總抗氧化能力(T-AOC)，超氧化物歧化酶(SOD)，

3、過氧化氫酶(CAT)，核轉錄因子E2相關因子2(transcription factor NF-E2-related factor2,Nrf2)蛋白，Nff2 mRNA,血紅素加氧酶-1（heineoxygenase-1，HO-1），NAD(P)H醌氧化還原酶1(NQO1，NAD(P)H quinone oxidoreductase1)等指標的影響，進而深入探討NMDA受體阻滯劑對梗阻性黃疸所致大腦氧化應激損傷是否具有保護作用及其具體機

4、制。論文第三部分主要通過白藜蘆醇對梗阻性黃疸大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內MDA，SOD及HO-1研究其在氧化應激損傷的過程中的作用。
　　第一部分 MK-801對梗阻性黃疸大鼠中樞神經(jīng)抗氧化應激系統(tǒng)的影響
　　目的:本部分研究的目的在于成功建立梗阻性黃疸大鼠模型，并探討MK-801對梗阻性黃疸大鼠中樞神經(jīng)抗氧化應激系統(tǒng)的影響。
　　方法:20只大鼠隨機分為四組:Ⅰ組（假手術組）、Ⅱ組（對照組）、Ⅲ組（低劑量處理組）和Ⅳ組（高劑量

5、處理組），Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ組為梗阻性黃疸模型組，Ⅲ，Ⅳ組為MK-801組。第2天起Ⅲ組腹腔注射MK-801，0.025mg/kg·d，Ⅳ組腹腔注射MK-801，0.25mg/kg·d;Ⅰ組和Ⅱ組以等容量生理鹽水同時注射。四組大鼠術后3d采尾部靜脈血以全自動生化儀檢查血清總膽紅素和直接膽紅素濃度來確定模型制作是否成功，術后10天處死大鼠并取材（大腦皮質）按試劑盒要求行MDA及CAT、T-SOD、T-AOC含量或活性測定。
　　結果:

6、>　　1.假手術組實驗鼠術后當日即恢復飲食及自由活動，且活動靈敏，小便淡黃。梗阻性黃疸模型組大鼠第2天開始出現(xiàn)尾尖及耳部等皮膚較薄的部位黃染，并逐漸出現(xiàn)全身黃染，尿液深黃，精神萎靡、反應遲緩。術后第三天，對照組、MK-801低劑量組、MK-801高劑量組大鼠大腦組織中直接膽紅素的濃度和總膽汁酸含量（μmol/L）與假手術組相比明顯增高，且有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，考慮梗阻性黃疸模型制作成功。
　　2.對照組、MK-801低劑量

7、組、MK-801高劑量組丙二醛的含量與假手術組相比升高，且有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。應用MK-801后丙二醛含量與對照組相比降低，且具有統(tǒng)計學意義，但MK-801高、低劑量組之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　3.對照組氧化氫酶活性與假手術組相比降低，MK-801組過氧化氫酶活性比對照組明顯增高，且有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。MK-801低劑量組、MK-801高劑量組之間過氧化氫酶活性無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)

8、　　4.對照組總超氧化物歧化酶活性比假手術組降低，且有統(tǒng)計學意義，MK-801組總超氧化物岐化酶活性與對照組相比明顯增高，且有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。MK-801高劑量組總超氧化物岐化酶活性與低劑量組相比無統(tǒng)計學差異。
　　5.對照組、MK-801低劑量組、MK-801高劑量組總抗氧化能力與假手術組相比明顯增高，且有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。MK-801組比對照組總抗氧化能力升高，但高劑量組與對照組之間相比無統(tǒng)計學差異(P＞

9、0.05)。
　　結論:
　　1.通過結扎實驗動物膽總管可以成功建立梗阻性黃疸動物模型。
　　2.梗阻性黃疸時中樞神經(jīng)系統(tǒng)機體存在氧化應激反應，機體通過增加過氧化氫酶等抗氧化應激損傷酶類的表達使抗氧化應激損傷能力增強，這與國內外目前研究一致。
　　3.MK-801使梗阻性黃疸所致大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化應激損傷的過程中脂質過氧化程度降低，并且可以提高SOD的活性及機體總抗氧化應激能力，高劑量的MK-801與低劑量的M

10、K-801相比效果并未明顯增加，反而使T-SOD活性比低劑量組降低，具體機制需要進一步研究。
　　第二部分 Keap1-Nrf2-ARE信號通路在梗阻性黃疸大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化應激損傷中的作用探討
　　目的:研究Keap1-Nrf2-ARE信號通路在梗阻性黃疸大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化應激損傷中的作用及在機體氧化應激反應過程中NMDA受體阻滯劑對Keap1-Nrf2-ARE信號通路的影響
　　方法:四組大鼠分別為:Ⅰ組（假手

11、術組）、Ⅱ組（對照組）、Ⅲ組（低劑量處理組）和Ⅳ組（高劑量處理組），Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ組為梗阻性黃疸模型組，第2天起Ⅲ組腹腔注射MK-801，0.025mg/kg.d，Ⅳ組腹腔注射MK-801，0.25mg/kg.d，連續(xù)注射10d;Ⅰ組和Ⅱ組以等容量生理鹽水同時注射。術后10天取材以Western bolt行HO-1，NQO1，Nrf2蛋白，以RT-PCR行Nrf2 mRNA測定。
　　結果:
　　1.與假手術組相比，OJ組Nrf

12、2 mRNA表達均明顯升高，且均有統(tǒng)計學差異，P＜0.05。MK-801組與對照組相比Nrf2 mRNA表達升高且有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。高劑量組與對照組相比Nrf2 mRNA表達降低，但無統(tǒng)計學差異，P＞0.05。
　　2.與假手術組相比，OJ組Nrf2蛋白表達均增高，且有統(tǒng)計學意義，P＜0.05; MK-801組與對照組相比Nrf2蛋白表達增高，且有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。不同的是高劑量組與低劑量組相比Nrf2蛋白表達減

13、低，而且具有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。
　　3.OJ組與假手術組相比HO-1蛋白表達增高，且有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。MK-801組與對照組相比HO-1蛋白表達增高，且有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。高低劑量MK-801組比低劑量組相比，HO-1表達水平降低，且具有統(tǒng)計學差異P＜0.05。
　　4.OJ組與假手術組相比NQO1蛋白表達增高，且有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。MK-801組與對照組相比NQ01蛋白表達增高，且有統(tǒng)計學

14、意義，P＜0.05。高低劑量MK-801組比低劑量組相比，NQO1表達水平降低，且具有統(tǒng)計學差異P＜0.05。
　　結論:
　　1.再一次驗證梗阻性黃疸時機體存在氧化應激反應。
　　2.機體通過Keap1-Nrf2-ARE信號通路增強了HO-1和NQO1及Nrf2蛋白的表達，增強了自身抗氧化應激能力。
　　3.NMDA受體阻滯劑MK-801通過Keap1-Nrf2-ARE信號通路上調了Ⅱ相解毒酶HO-1和NQO-

15、1的蛋白表達，增加了機體抗氧化應激反應能力，從而發(fā)揮了它的神經(jīng)保護作用。雖然高、低劑量的MK-801均能達到此作用，但高劑量的MK-801反而使Nrf2 mRNA、Nrf2蛋白、HO-1和NQ01蛋白的表達較低劑量組降低，可能與MK-801毒性作用有關。
　　第三部分 不同水平白藜蘆醇對梗阻性黃疸大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化應激損傷的影響
　　目的:通過對研究梗阻性黃疸大鼠大腦皮質中氧化應激指標表達水平來探討不同水平白藜蘆醇對梗阻性

16、黃疸大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化應激損傷的影響及其氧化應激損傷中的保護作用和機制。
　　方法:選擇32只6周齡的雄性SD大鼠作為實驗對象，將其隨機分為四個組別，分籠飼養(yǎng)，每組8只，A組大鼠進行梗阻性黃疸假手術（只將膽總管游離出來，不做結扎），B、C、D組大鼠均進行手術制備梗阻性黃疸模型，術后每日C、D兩組大鼠分別給予不同劑量的白藜蘆醇溶液灌胃，A、B組則給予同等劑量生理鹽水灌胃。分別在手術后的第14d采集血液標本行總膽紅素、直接膽紅素、谷

17、丙轉氨酶、谷草轉氨酶測定，并采集大腦皮質標本，并對其中中丙二醛、超氧化物歧化酶活性、HO-1水平進行檢測，觀察不同組別的大鼠各項指標之間的差異。
　　結果:術后TBIL及DBIL指標結果證明Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ三組大鼠梗阻性黃疸模型制作成功。OJ組ALT、AST、MDA水平比假手術組升高，SOD、HO-1水平比假手術組降低。OJ組內反應肝功能損害指標ALT，AST及反應氧化應激損傷指標MDA的平均水平呈Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅳ的趨勢，而氧化應激保護性指標