氧化應(yīng)激與神經(jīng)炎癥在1-溴丙烷致大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的作用.pdf

1、研究目的：
　　1-溴丙烷(1-Bromopropane，1-BP)是一種高揮發(fā)性有機(jī)化合物，在大氣中的半衰期約為15天，存在時(shí)間短。在中緯度地區(qū)，1-BP臭氧消耗潛能(ozonedepleting potential，ODP)較低約為0.013-0.018，故可作為臭氧消耗物質(zhì)（ozone-depleting solvents，ODS）如氯氟烴(chlorofluorocarbons，CFCs)和氫氯氟烴(hydrochloro

2、fluorocarbons，HCFCs)的替代物使用。1-BP用于清洗金屬、塑料、電子和光學(xué)元件，還可作為脂肪、蠟和樹脂的溶劑，也是生產(chǎn)殺蟲劑、季胺類化合物、藥物和香料的中間產(chǎn)物。在人類病例和動物實(shí)驗(yàn)中，1-BP均能夠引起周圍神經(jīng)系統(tǒng)(peripheral nervous system，PNS)感覺和運(yùn)動障礙，以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）毒性如記憶損傷、疲勞和抑郁等。研究發(fā)現(xiàn)CNS癥狀的出現(xiàn)早

3、于PNS，而且記憶損傷可以作為CNS毒性的指標(biāo)并在動物實(shí)驗(yàn)中可以通過Morris水迷宮進(jìn)行準(zhǔn)確測量。所以通過記憶損傷研究1-BPCNS毒性的劑量反應(yīng)關(guān)系、可能涉及的毒性機(jī)制和生物標(biāo)志物對于1-BP中毒的早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早治療具有重要意義。
　　對以記憶損傷為癥狀的神經(jīng)退行性疾病如阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)和帕金森病(Parkinson's disease，PD)的研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激與記憶損傷可能具

4、有病因?qū)W聯(lián)系。在CNS，谷胱甘肽(glutathione，GSH)是主要的抗氧化劑，對活性氧（reactive oxygen species，ROS）和外源化合物的解毒起到了重要的作用。因此，穩(wěn)定的GSH含量利于維持正常CNS功能，GSH耗竭可能導(dǎo)致記憶損傷。腦紅蛋白（neuroglobin，Ngb）是新發(fā)現(xiàn)的存在于大腦中的內(nèi)源性抗氧化劑，具有神經(jīng)保護(hù)作用，與認(rèn)知功能密切相關(guān)。Ngb含量和神經(jīng)保護(hù)作用的發(fā)揮也依賴于細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)。記

5、憶功能依賴于神經(jīng)元的完整，記憶喪失往往伴隨著神經(jīng)元的損傷和丟失。神經(jīng)元的功能與星形膠質(zhì)細(xì)胞聯(lián)系緊密。氧化損傷能激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，激活狀態(tài)的星形膠質(zhì)細(xì)胞會釋放炎性介質(zhì)和ROS作用于神經(jīng)元并最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡。ROS、前炎性因子如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisfactor-α，TNF-α)等都是星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活劑。本課題使用0，100，200，400，800mg/kg bw1-BP對大鼠進(jìn)行染毒，觀察在1-BP致記憶損傷

6、的過程中大腦皮層內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(medial prefrontal cortex，mPFC)病理、Ngb含量、GSH代謝、星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化及其與1-BP染毒劑量的關(guān)系，并通過基準(zhǔn)劑量法尋找1-BPCNS毒性中較敏感的效應(yīng)標(biāo)志物，探討氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥在1-BP致CNS毒性中的作用。
　　方法：
　　1.動物處理:雄性Wistar大鼠(180-220g)85只，經(jīng)5d適應(yīng)性喂養(yǎng)，大鼠被隨機(jī)分為5組(n=17)，分別為對照組和

7、1-BP染毒組(染毒劑量分別為100、200、400、800 mg/kg bw)。1-BP使用玉米油稀釋，大鼠經(jīng)灌胃連續(xù)給予1-BP12d，對照組給予等體積玉米油，灌胃體積為0.2 ml/100g bw。實(shí)驗(yàn)第13d斷頭處死大鼠（每組10只），迅速剝離大腦皮層，放于-80℃待測;每組7只大鼠進(jìn)行心臟灌注，制備石蠟和冰凍切片。
　　2.大鼠認(rèn)知功能測定:染毒第8d至12d，大鼠進(jìn)行Morris水迷宮測試。定位航行試驗(yàn)中逃避潛伏期和游

8、泳路程能夠表現(xiàn)大鼠學(xué)習(xí)能力，空間探索試驗(yàn)中穿越平臺次數(shù)和目標(biāo)象限時(shí)間百分比可以反映大鼠記憶能力。
　　3.大鼠mPFC神經(jīng)元數(shù)量檢測:免疫組化染色檢測神經(jīng)元標(biāo)志蛋白NeuN，選取mPFC邊緣前區(qū)(prelimbic area，PL)進(jìn)行神經(jīng)元計(jì)數(shù)。
　　4.大腦皮層氧化應(yīng)激指標(biāo):試劑盒檢測GSH、氧化型谷胱甘肽(oxidizedglutathione，GSSG)、谷氨酸半胱氨酸連接酶（glutamate cysteine l

9、igase，GCL）活性;western blot檢測脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物，如4-羥基-2-壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal，4-HNE)和 n-epsilon-己酰-賴氨酸（n-epsilon-hexanoyl-lysine，HEL）的蛋白質(zhì)加合物;western blot檢測Ngb含量變化。
　　5.大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞激活情況:免疫熒光檢測膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillary acidic protei

10、n，GFAP）（激活的標(biāo)志性蛋白）觀察大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況;western blot檢測GFAP蛋白含量。
　　6.大腦皮層前炎性因子的測定:qRT-PCR檢測前炎性因子TNF-α的mRNA含量。
　　7.基準(zhǔn)劑量法計(jì)算效應(yīng)標(biāo)志物的基準(zhǔn)劑量(benchmark dose，BMD)和BMD的可信限下限(BMD lower confidence limit，BMDL)。
　　結(jié)果：
　　1.1-BP染毒大鼠

11、出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙:水迷宮結(jié)果顯示，與對照組相比，200、400和800 mg/kg bw1-BP組大鼠逃避潛伏期顯著增加、目標(biāo)象限時(shí)間百分比顯著減少(p＜0.05，p＜0.01)，400和800 mg/kg bw1-BP組大鼠游泳路程顯著增加、穿越平臺次數(shù)顯著減少(p＜0.05，p＜0.01)。
　　2.1-BP造成大鼠PL神經(jīng)元減少:與對照組相比，100、200、400和800 mg/kgbw1-BP組大鼠PL區(qū)域第5層神經(jīng)元數(shù)

12、量呈劑量依賴性降低(p＜0.01)，第2/3層和第6層無顯著變化。
　　3.1-BP引起氧化應(yīng)激:與對照組相比，100、200、400和800 mg/kg bw1-BP組大鼠大腦皮層GSH含量、GSH/GSSG比值和GCL活性顯著減少(p＜0.01)，GSSG含量顯著增加(p＜0.01);1-BP染毒大鼠大腦皮層4-HNE和HEL氧化修飾蛋白含量顯著增加(p＜0.01);200、400和800 mg/kg bw1-BP組大鼠大腦皮

13、層Ngb含量呈劑量依賴性減少(p＜0.01)。
　　4.1-BP導(dǎo)致大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著激活:免疫熒光GFAP染色顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著激活;與對照組相比，1-BP染毒組大鼠大腦皮層GFAP蛋白含量顯著升高(p＜0.01)。
　　5.1-BP引起前炎性因子TNF-α表達(dá)上調(diào):qRT-PCR結(jié)果顯示1-BP染毒組大鼠大腦皮層TNF-α的mRNA水平顯著增加(p＜0.05)。
　　6.大腦皮層GSH/GSSG比值是反映1

14、-BP CNS毒性較敏感的指標(biāo)。行為學(xué)效應(yīng)指標(biāo)逃避潛伏期(第4d)、游泳路程(第4d)、目標(biāo)象限時(shí)間百分比和穿越平臺次數(shù)的1-BP的BMDL分別為49.39、75.90、73.11和97.67 mg/kg.bw/day;生化效應(yīng)指標(biāo)大腦皮層GSH含量、GSH/GSSG比值和GCL活性的1-BP的BMDL分別為59.61、23.40和64.85 mg/kg.bw/day。
　　結(jié)論：
　　1.1-BP能夠引起大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷，

15、這可能與1-BP導(dǎo)致記憶功能的重要參與者mPFC的PL第5層神經(jīng)元數(shù)量減少有關(guān)。
　　2.1-BP能夠造成GSH耗竭、引起脂質(zhì)過氧化并降低對神經(jīng)元有保護(hù)作用的Ngb的含量。氧化損傷和神經(jīng)保護(hù)物質(zhì)的減少可能與神經(jīng)元丟失有關(guān)。
　　3.1-BP引起星形膠質(zhì)細(xì)胞激活，前炎性因子TNF-α表達(dá)上調(diào)。神經(jīng)元丟失可能與激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)和ROS導(dǎo)致神經(jīng)元受損和死亡有關(guān)。
　　4.大腦皮層GSH/GSSG比值是反映1-B