渤海和北黃海海域沉積物中可培養(yǎng)產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶細(xì)菌的多樣性研究.pdf

1、黃渤海域是中國的陸源淺海，其海底沉積物中蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源，在海洋生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)中扮演著重要的角色。本研究采用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法和現(xiàn)代分子生物學(xué)方法分別對渤海和北黃海海底沉積物中產(chǎn)胞外蛋白酶、脂肪酶細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，揭示渤海和北黃海沉積物中可培養(yǎng)產(chǎn)胞外蛋白酶、脂肪酶細(xì)菌的多樣性，增加人們對黃渤海域生態(tài)系統(tǒng)中產(chǎn)胞外酶細(xì)菌多樣性的認(rèn)識，為挖掘海洋產(chǎn)蛋白酶、脂肪酶微生物提供菌群資源。
　　采用酪蛋白明膠培養(yǎng)基，從北黃海5個海底沉積物樣

2、品中分離到66株蛋白酶的細(xì)菌菌株，通過16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，這66株菌隸屬于4個不同門的7個屬，包括擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門（Firmicutes）四個門的7個屬，其中Pseudoalteromonas(69.9％)、Sulfitobacter(12.1％)和Salegentibacter(10.6％)是優(yōu)勢屬。沉

3、積物樣品中的可培養(yǎng)的產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌達(dá)到104 CFU/g的豐度。分別測定胞外蛋白酶活性并對選定菌株進(jìn)行基于苯甲基磺酰氟（PMSF，絲氨酸蛋白酶抑制劑）、鄰菲羅啉（o-phenanthroline，O-P，金屬蛋白酶抑制劑）、E-64（半胱氨酸蛋白酶抑制劑）和pepstatinA（天冬氨酸蛋白酶抑制劑）四種抑制劑的酶活抑制實驗以及所有菌株對三種底物（酪蛋白、明膠、彈性蛋白）的水解能力分析這些細(xì)菌所產(chǎn)胞外蛋白酶的特性及多樣性，實驗結(jié)果顯示有3

4、9株菌能夠產(chǎn)生足夠量的酶用于蛋白酶抑制劑實驗。抑制劑實驗表明39株測定菌株產(chǎn)生的胞外蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶和/或金屬蛋白酶，僅有少數(shù)菌株所產(chǎn)蛋白酶具有半胱氨酸蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶活性。對所有菌株進(jìn)行三種底物的水解實驗表明，所有菌株能降解酪蛋白和/或明膠，Pseudoalteromonas和Salegentibacter菌株具有水解彈性蛋白的能力，Salegentibacter菌株對三種底物具有更強(qiáng)的蛋白水解能力。
　　用同樣的方

5、法，從渤海菜州灣7個沉積物樣品中篩選到121株產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌，它們隸屬于Firmicutes、Actinobacteria、Proteobacteria和Bacteroidetes四個門的17個屬，Bacillus、Pseudoalteromonas和Photobacterium是優(yōu)勢屬。蛋白酶抑制劑實驗表明，有62株菌能夠產(chǎn)生足夠量的酶用于蛋白酶抑制劑實驗且均被PMSF抑制，抑制率為19.36％～100％，27株菌的蛋白酶酶活被OP抑制

6、，抑制率為21.12％～66.37％，E-64對7株菌的蛋白酶酶活有抑制作用，抑制率為12.14％～65.11％， Pepstatin A對7株菌的蛋白酶酶活有抑制作用，抑制率為12.91％～34.5％，測定菌株所產(chǎn)胞外蛋白酶主要是絲氨酸蛋白酶和/或金屬蛋白酶。通過對所有菌株進(jìn)行三種底物的水解實驗表明，Bacillus屬的菌株對酪蛋白、明膠和彈性蛋白表現(xiàn)出較高的水解能力。
　　采用吐溫80培養(yǎng)基和三丁酸甘油酯篩選平板，從8個渤海沉

7、積物樣品中分離獲得51株產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌，通過對這51株菌的16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，這些菌株隸屬于Bacteroidetes、Proteobacteria和Firmicutes三個門的8個屬，其中Pseudoalteromonas(35.2％)、Marinobacter(23.5％)和Sulfitobacter(17.6％)是優(yōu)勢菌群。以對硝基苯酚棕櫚酸酯(PNPP)為底物，利用對硝基苯酚法測定所有菌株胞外脂肪酶活性，結(jié)果顯示