土壤及海底沉積物中可培養(yǎng)與未可培養(yǎng)粘細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性研究.pdf

1、粘細(xì)菌(Myxobacteria)是一類革蘭氏陰性滑動(dòng)細(xì)菌。粘細(xì)菌由于具有復(fù)雜的細(xì)胞社會(huì)行為和能形成多細(xì)胞聚集、形態(tài)特異的子實(shí)體結(jié)構(gòu)而被視為“高等細(xì)菌”。具有鮮明色彩的子實(shí)體是在環(huán)境條件惡劣或營(yíng)養(yǎng)條件貧瘠的情況下，由成千上萬(wàn)的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞聚集并分化發(fā)育而成的。由于粘細(xì)菌子實(shí)體及其內(nèi)含粘孢子的抗逆性，粘細(xì)菌能夠廣泛地分布在地球的各個(gè)地方，特別在土壤、腐木、樹(shù)皮和動(dòng)物糞便中最為普遍。但是粘細(xì)菌的生態(tài)學(xué)研究明顯滯后于其它土壤微生物，這是因?yàn)檎臣?xì)菌

2、的許多特殊性狀使得粘細(xì)菌的分離與純化相對(duì)于其它細(xì)菌更為耗時(shí)和困難；同時(shí)，由于粘細(xì)菌子實(shí)體結(jié)構(gòu)容易退化和丟失，因此傳統(tǒng)的粘細(xì)菌分離純化方法容易遺漏粘細(xì)菌菌株。因此，分離到的可培養(yǎng)粘細(xì)菌可能只是代表了自然環(huán)境中粘細(xì)菌類群的一小部分。隨著不依賴培養(yǎng)(Cultivation Independent)方法的完善和發(fā)展，研究者已經(jīng)有能力對(duì)環(huán)境中那些行使重要功能但至今無(wú)法培養(yǎng)的微生物進(jìn)行群落組成和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等方面的分析：同時(shí)隨著公共核酸數(shù)據(jù)庫(kù)Gen

3、Bank中粘細(xì)菌16S rRNA基因序列的快速、大量增加也使我們通過(guò)分子生物學(xué)方法分析環(huán)境中粘細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性成為可能。在本研究中，我們利用粘細(xì)菌傳統(tǒng)的分離純化方法以及分子生態(tài)學(xué)方法來(lái)研究土壤及海底沉積物中粘細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及其生態(tài)多樣性。 1. 我們從實(shí)驗(yàn)室粘細(xì)菌資源菌庫(kù)中選取了37株粘細(xì)菌菌株進(jìn)行形態(tài)鑒定和菌株親緣關(guān)系的分析。粘細(xì)菌的形態(tài)特征，尤其是子實(shí)體形態(tài)是粘細(xì)菌種屬分類的主要依據(jù)，但由于子實(shí)體結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)很容

4、易退化甚至是丟失，給這些菌株的準(zhǔn)確分類帶來(lái)了很大的困難，如本研究中的孢囊桿菌亞目(Cystobacterineae)菌株0082-2、0085-4、0121-3、Myx9736和NM03以及堆囊菌亞目(Sorangineae)菌株So0007-16、So0157-52和So139-5的子實(shí)體結(jié)構(gòu)都發(fā)生了不同程度的退化。通過(guò)對(duì)菌株16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分析，能夠提高傳統(tǒng)形態(tài)分類的準(zhǔn)確性。在本研究中，通過(guò)對(duì)孢囊桿菌亞目15

5、株菌株和堆囊菌亞目22株菌株的16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分析表明，大多數(shù)的粘細(xì)菌屬在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上能形成各自獨(dú)立的分支。說(shuō)明在屬及屬以上水平，粘細(xì)菌形態(tài)分類和16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系具有較好的一致性。但在種水平上16S rRNA基因序列所揭示的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系可靠性較低。在此，我們使用了HSP60(groEL)基因序列來(lái)分析粘細(xì)菌近緣菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。在本研究中，我們得到了孢囊桿菌亞目5株菌株和堆囊菌亞目堆囊菌屬

6、(Sorangium)22株菌株的groEL1部分基因序列。通過(guò)分析系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系表明，groEL1基因能夠更為準(zhǔn)確的揭示粘細(xì)菌種屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，彌補(bǔ)了16S rRNA基因序列在鑒定粘細(xì)菌種屬中的不足。同時(shí)發(fā)現(xiàn)粘細(xì)菌具有重復(fù)拷貝的HSP60基因，并擴(kuò)增得到了9株堆囊菌屬菌株的groEL2基因。通過(guò)分析系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系發(fā)現(xiàn)，groEL2基因也可以作為堆囊菌屬內(nèi)系統(tǒng)進(jìn)化分析的分子標(biāo)記，且相同菌株不同拷貝的groEL基因序列同源性都在78％左右

7、，這暗示著重復(fù)拷貝的groEL基因來(lái)源于同一個(gè)祖先基因，但卻表現(xiàn)出明顯不同的進(jìn)化速率。 2.利用本研究得到的37個(gè)粘細(xì)菌菌株16S rRNA基因序列和70個(gè)GenBank中已公布的粘細(xì)菌16S rRNA基因序列信息來(lái)設(shè)計(jì)粘細(xì)菌亞目水平特異的寡核苷酸引物/探針，以從SDU土樣中提取的總DNA為模板，建立了W1/1492R和W4/1492R兩個(gè)類型文庫(kù)來(lái)分別富集孢囊桿菌亞目和堆囊菌亞目的粘細(xì)菌相關(guān)序列，通過(guò)粘細(xì)菌特異探針W2和W5雜交篩選陽(yáng)

8、性克隆并測(cè)序以分析土壤中粘細(xì)菌組成多樣性。在SDU土壤樣品中，我們從富集平板上分離到了7株粘細(xì)菌菌株，但分析土壤16S rRNA基因序列說(shuō)明土壤中可能存在著大量的粘細(xì)菌類群，能出現(xiàn)在富集平板上的粘細(xì)菌只代表了土壤中粘細(xì)菌類群的一小部分。在孢囊桿菌亞目，可培養(yǎng)粘細(xì)菌序列只能被分為4個(gè)分支。然而，我們分析土壤中未可培養(yǎng)粘細(xì)菌序列發(fā)現(xiàn)至少存在12個(gè)分支，包括上述己知的4個(gè)分支；在堆囊菌亞目，至少存在著5個(gè)分支，所有已報(bào)道的堆囊菌亞目菌株都位于

9、分支I內(nèi)，另外4個(gè)分支都由未可培養(yǎng)的粘細(xì)菌序列組成。 3.通過(guò)上述環(huán)境DNA技術(shù)的方法發(fā)現(xiàn)土壤生境中存在大量未可培養(yǎng)粘細(xì)菌，但該方法是基于DNA水平，不能說(shuō)明這些未可培養(yǎng)粘細(xì)菌的狀態(tài)。因此我們又進(jìn)一步從土壤RNA出發(fā)，通過(guò)建立孢囊桿菌亞目和堆囊菌亞目富集的粘細(xì)菌16S crDNA文庫(kù)，并利用特異探針W2和W5進(jìn)行了文庫(kù)的篩選和測(cè)序分析。我們得到了83個(gè)活性粘細(xì)菌的16S crDNA序列。進(jìn)一步比較可培養(yǎng)粘細(xì)菌、基于土壤DNA的分

10、子生態(tài)數(shù)據(jù)和基于土壤RNA的分子生態(tài)數(shù)據(jù)顯示，盡管傳統(tǒng)分離方法只能發(fā)現(xiàn)7株粘細(xì)菌菌株，但環(huán)境中存在著大量具有代謝活性的未可培養(yǎng)粘細(xì)菌，這也說(shuō)明了我們所使用的傳統(tǒng)分離方法的局限性。而且結(jié)果顯示，這些活躍代謝表達(dá)的粘細(xì)菌類群，不但與我們通過(guò)傳統(tǒng)分離方法得到的粘細(xì)菌菌株不一致，也和我們通過(guò)DNA水平出發(fā)得到的結(jié)果有較大的出入。進(jìn)一步說(shuō)明了無(wú)論是分離到的粘細(xì)菌菌株還是DNA水平得到的粘細(xì)菌序列都不能真實(shí)地反映在生境中具有較高代謝活性、行使生態(tài)功

11、能的活性粘細(xì)菌類群的組成。 4.粘細(xì)菌通常被認(rèn)為是土壤微生物，但是近幾年，海洋嗜鹽粘細(xì)菌和海洋耐鹽粘細(xì)菌都陸續(xù)地被發(fā)現(xiàn)。在本研究中，以來(lái)自不同海底深度的10個(gè)海底沉積物樣品為研究材料，利用傳統(tǒng)的分離純化方法進(jìn)行可培養(yǎng)海洋粘細(xì)菌的分離，但并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)可培養(yǎng)粘細(xì)菌的存在，說(shuō)明在海底沉積物中形成子實(shí)體的可培養(yǎng)粘細(xì)菌非常之少。為了了解海底沉積物中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)以及粘細(xì)菌在細(xì)菌群落中的豐度情況，我們分別對(duì)853m和4794m深度的海底沉積物樣品91

12、6-1和7K367 M2-1構(gòu)建了細(xì)菌普通16S rRNA基因文庫(kù)，并隨機(jī)選取這兩個(gè)文庫(kù)的克隆子進(jìn)行測(cè)序，分別得到了88個(gè)和93個(gè)序列。分析這些序列表明，位于4794m的7K367 M2-1海底沉積物中沒(méi)有粘細(xì)菌相關(guān)的序列發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明在7K367M2-1海底沉積物中粘細(xì)菌占細(xì)菌總數(shù)的比例較低(小于1％);而位于853m的916-1海底沉積物中，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)粘細(xì)菌相關(guān)序列，占細(xì)菌總數(shù)的3.4％，說(shuō)明在海底沉積物916-1中粘細(xì)菌占細(xì)菌總數(shù)的比

13、例并不像土壤中的情況那樣比例較低(SDU土壤中粘細(xì)菌占細(xì)菌總數(shù)不到1％)。 隨后，我們分別對(duì)5個(gè)不同深度的海底沉積物樣品建立了W1/1492R和W4/1492R兩個(gè)類型的粘細(xì)菌富集文庫(kù)，但對(duì)文庫(kù)進(jìn)行雜交篩選并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)。我們認(rèn)為產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能是探針W2和W5都是從可培養(yǎng)陸生粘細(xì)菌的16S rRNA基因出發(fā)而設(shè)計(jì)的，而在海洋環(huán)境中存在的粘細(xì)菌可能與陸生粘細(xì)菌有很大的不同，這兩個(gè)探針不能夠覆蓋到海洋粘細(xì)菌類群中，以至于

14、不能通過(guò)探針W2和W5來(lái)篩選海洋粘細(xì)菌。因此，我們隨機(jī)挑取了各個(gè)文庫(kù)的克隆子進(jìn)行測(cè)序分析。通過(guò)測(cè)序得到了68個(gè)粘細(xì)菌相關(guān)序列。分析這些序列與可培養(yǎng)粘細(xì)菌的代表菌株序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系發(fā)現(xiàn)，孢囊桿菌亞目的可培養(yǎng)粘細(xì)菌分支內(nèi)并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)海洋粘細(xì)菌相關(guān)序列，說(shuō)明在海洋環(huán)境中孢囊桿菌亞目的可培養(yǎng)粘細(xì)菌很少，而這個(gè)亞目菌株絕大部分都是從來(lái)源于陸地環(huán)境的樣品中分離得到，說(shuō)明了這類菌株比較適合在陸地環(huán)境中生存；在堆囊菌亞目中，只有來(lái)自D-030樣品的克隆

15、D030-W4-42序列位于這個(gè)分支內(nèi)，但與分支內(nèi)的其它序列同源性較低，只有91％左右。而未可培養(yǎng)海洋粘細(xì)菌主要與可培養(yǎng)海洋粘細(xì)菌SMP-2等處于一個(gè)分支內(nèi)，來(lái)自陸地的小囊菌屬(Nannocysits)內(nèi)沒(méi)有未可培養(yǎng)海洋粘細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)。 5.為了進(jìn)一步分析未可培養(yǎng)海洋粘細(xì)菌與未可培養(yǎng)陸生粘細(xì)菌、可培養(yǎng)粘細(xì)菌之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，我們將土壤中未可培養(yǎng)粘細(xì)菌序列和所有可培養(yǎng)粘細(xì)菌序列與未可培養(yǎng)海洋粘細(xì)菌序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。結(jié)果顯示，我們可

16、以將所有粘細(xì)菌序列分為4個(gè)大分支，分別代表了亞目水平的孢囊桿菌亞目、堆囊菌亞目、小囊菌亞目(Nannocyslineae)和一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的未知亞目?？膳囵B(yǎng)陸地粘細(xì)菌分布于孢囊桿菌亞目、堆囊菌亞目和小囊菌亞目三個(gè)分支內(nèi)，但它們分布的范圍非常之小，只占了粘細(xì)菌類群的很小一部分，其它大部分是來(lái)自于未可培養(yǎng)粘細(xì)菌。我們新發(fā)現(xiàn)的未知亞目的大多數(shù)是由來(lái)自海洋的未可培養(yǎng)粘細(xì)菌組成。而小囊菌亞目的分支除了少數(shù)陸生小囊菌屬菌株序列和可培養(yǎng)海洋粘細(xì)菌外，大多

17、數(shù)是由我們得到的未可培養(yǎng)海洋粘細(xì)菌序列所組成。 本課題建立了一整套用于粘細(xì)菌系統(tǒng)分類和生態(tài)研究的分子生物學(xué)方法，在國(guó)際上首次利用分子生態(tài)學(xué)方法，對(duì)粘細(xì)菌在土壤生境中的生態(tài)分布和多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了大量未可培養(yǎng)的粘細(xì)菌新的未知類群；同時(shí)首次利用大量海底沉積物樣品來(lái)分析海洋環(huán)境中粘細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性，取得的結(jié)果填補(bǔ)了粘細(xì)菌相關(guān)研究領(lǐng)域的空白，也得到了國(guó)際上權(quán)威專家的認(rèn)可，使本實(shí)驗(yàn)室在此領(lǐng)域處于國(guó)際領(lǐng)先水平。下一步，我們將對(duì)發(fā)現(xiàn)