大鼠脊髓橫斷后應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)SiNgR-199的療效分析.pdf

1、本研究擬構(gòu)建NgR特異性小干擾RNA慢病毒重組體，優(yōu)化NgR特異性小干擾RNA的合成、遞呈，通過病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)體外進(jìn)行大鼠原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞RNA干擾，驗(yàn)證其有效性并確定最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)；最后在大鼠脊髓橫斷損傷模型證實(shí)慢病毒介導(dǎo)的NgR特異性siRNA能夠成功長期下調(diào)NgR蛋白表達(dá)，一定程度上促進(jìn)損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)和神經(jīng)纖維再生。 目的： 1．在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)、構(gòu)建介導(dǎo)NgR特異性小干擾RNA序列的慢病毒重

2、組體。 2．驗(yàn)證于大鼠原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)中慢病毒重組體可以成功轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞，引發(fā)內(nèi)源性NgR基因沉默。并確定體內(nèi)最佳轉(zhuǎn)染濃度。 3．觀察大鼠脊髓橫斷損傷模型應(yīng)用慢病毒重組體沉默NgR基因后對神經(jīng)軸突再生和神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，為進(jìn)一步應(yīng)用臨床試驗(yàn)提供理論依據(jù)。 方法： 1．按照Elbashir等設(shè)計(jì)原則和siRNA表達(dá)載體的要求，設(shè)計(jì)構(gòu)建NgR特異siRNAl99慢病毒重組體，并進(jìn)行酶切鑒定及基因測序

3、；通過轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞確定最佳轉(zhuǎn)染濃度和感染復(fù)數(shù)(MOI值)。 2．體外培養(yǎng)大鼠原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞，培養(yǎng)后第7天，進(jìn)行不同滴度的重組慢病毒轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染情況，確定最佳MOI值及活體應(yīng)用病毒量，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測內(nèi)源性NgR基因沉默效果； 3．建立大鼠脊髓橫斷損傷模型；51只成年雌性S～D大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對照組(6只)、生理鹽水組(15只)、空慢病毒組(15只)、慢病毒重組體組(15只)，脊髓橫

4、斷損傷后7天皮層體感運(yùn)動(dòng)區(qū)分點(diǎn)微量注射給藥。損傷后8周(處死前1周)皮層體感運(yùn)動(dòng)區(qū)分點(diǎn)微量注射BDA示蹤劑順行示蹤。 4．傷后每周對大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行神經(jīng)功能行為學(xué)評分(BBB評分)；采用雙盲、雙人獨(dú)立觀察記錄法。給藥10天后熒光顯微鏡下觀察報(bào)告基因GFP表達(dá)情況；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測注射區(qū)皮層神經(jīng)元細(xì)胞NgR mRNA表達(dá)情況；免疫組化觀察NgR蛋白表達(dá)狀況，及脊髓損傷神經(jīng)修復(fù)情況。9周后觀察脊髓損傷區(qū)神

5、經(jīng)修復(fù)、再生情況。 結(jié)果： 1．構(gòu)建的NgR特異性siRNA199慢病毒重組體經(jīng)酶切鑒定，產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳DNA片段約6.4Kbp，經(jīng)基因測序儀測序，結(jié)果與設(shè)計(jì)序列完全相符，目的基因序列準(zhǔn)確無誤，慢病毒重組體構(gòu)建成功。 2．慢病毒重組體實(shí)現(xiàn)體外大鼠原代皮層神經(jīng)元轉(zhuǎn)染，96小時(shí)后神經(jīng)細(xì)胞開始表達(dá)綠色熒光，146小時(shí)表達(dá)綠色熒光最強(qiáng)；適合高效感染的MOI值為3；轉(zhuǎn)染192h后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，結(jié)果

6、顯示目的基因抑制效率為61％，取得較滿意的效果。 3.損傷后1周在大鼠脊髓橫斷損傷模型中行皮層體感運(yùn)動(dòng)區(qū)分點(diǎn)微量注射給藥，給藥10d后取注射區(qū)腦組織行RT-PCR檢測NgR mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示重組慢病毒注射組NgR mRNA的表達(dá)水平明顯低于生理鹽水注射組與空慢病毒注射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；注射區(qū)腦組織冰凍切片貼片行免疫組化檢測NgR蛋白表達(dá)情況，生理鹽水組及空慢病毒組可見清晰陽性細(xì)胞，重組慢病毒組NgR

7、染色陽性顆粒明顯減少，從而說明在活體內(nèi)大腦皮層微量注射慢病毒重組體轉(zhuǎn)染皮層神經(jīng)元細(xì)胞后成功實(shí)現(xiàn)了NgR基因的沉默。 4.BBB評分結(jié)果：手術(shù)大鼠在損傷后最初都表現(xiàn)為喪失所有后肢運(yùn)動(dòng)功能，BBB評分為0分。損傷后4周內(nèi)無明顯改變，第5周起，各組動(dòng)物均出現(xiàn)不同程度的后肢運(yùn)動(dòng)，BBB評分最高為3分。隨后逐漸上升，至第8周時(shí)最高達(dá)到8分；各實(shí)驗(yàn)組大鼠的神經(jīng)功能均有一定程度的恢復(fù)，但各組間BBB評分提高程度無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P>0.05)

8、。 5.組織學(xué)和神經(jīng)纖維染色檢查結(jié)果：重組慢病毒組脊髓橫斷損傷部位有更多髓鞘組織形成及膠質(zhì)細(xì)胞增生；BDA順行神經(jīng)示蹤觀察見重組慢病毒組有少量的軸突生長通過損傷區(qū)域，要明顯好于生理鹽水組及空慢病毒組。 結(jié)論： 設(shè)計(jì)、構(gòu)建的NgR特異性siRNA199慢病毒重組體，能夠在大鼠體外原代皮層神經(jīng)元轉(zhuǎn)染和體內(nèi)皮層運(yùn)動(dòng)區(qū)注射后穩(wěn)定地實(shí)現(xiàn)RNA干擾，較長時(shí)間下調(diào)神經(jīng)元的內(nèi)源性NgR mRNA表達(dá)，并在一定程度上促進(jìn)脊髓神經(jīng)軸