慢病毒介導的RNAi對佐劑性關節(jié)炎大鼠脊髓IL-33基因的沉默效應.pdf

1、第一章、慢病毒介導RNA干擾對體外培養(yǎng)大鼠膠質瘤細胞IL-33基因的沉默效應
　　目的：構建IL-33基因RNA干擾慢病毒載體并轉染體外培養(yǎng)的大鼠膠質瘤細胞，觀察其沉默效應。
　　方法：
　　1.針對大鼠IL-33基因特異性序列，設計3條IL-33-siRNA序列及1條陰性對照序列，合成包含各正義靶序列的互補DNA鏈，退火形成雙鏈DNA，插入到經HpaⅠ和XhoⅠ剪切的GV118的慢病毒載體種，PCR篩選陽性克隆，DN

2、A測序鑒定。與慢病毒包裝質粒pHelper1.0、pHelper2.0轉染至293T細胞，滴度測定后－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　2.慢病毒重組體轉染體外培養(yǎng)的膠質瘤細胞C6，觀察轉染效率。
　　3.倒置熒光顯微鏡下觀察C6細胞的形態(tài)改變，Real-Time PCR檢測慢病毒重組體對C6細胞IL-33mRNA的干擾效率。
　　結果：
　　1.測序結果證實合成的寡核苷酸鏈插入正確,重組載體構建成功,測定慢病毒滴度為L

3、V-IL33-RNAi(1)為1×109TU/ml；LV-IL33-RNAi(2)為8×108TU/ml；LV-IL33-RNAi(3)為1×109TU/ml。
　　2.慢病毒重組體能成功轉染至C6細胞，相對于陰性對照組，LV-IL-33-RNAi(1)，LV-IL-33-RNAi(2)，LV-IL-33-RNAi(3)組轉染至C6細胞后，IL-33mRNA表達水明降低，其中LV-IL33-RNAi(2)組敲減率最高達到了66.5

4、％，其差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論：成功構建了大鼠IL-33基因的RNA干擾慢病毒載體，其可使膠質瘤細胞C6的IL-33基因表達下調。這樣為我們下一步動物體內實驗奠定了基礎。也為神經系統(tǒng)IL-33基因功能研究提供一種有效工具。
　　第二章、脊髓IL-33對佐劑性關節(jié)炎大鼠外周炎癥及痛覺過敏的調控
　　目的：炎癥組織的傷害性刺激會增加脊髓背角神經元的興奮性即發(fā)生中樞敏化。神經元興奮后產生的信號可返回調控外

5、周炎癥，具體機制尚未明確。最近一些研究表明，脊髓IL-33參與了中樞敏化介導疼痛反應。我們的目的是研究脊髓IL-33是否也參與了大鼠佐劑性關節(jié)炎的外周炎癥反應及相關痛覺過敏。
　　方法：
　　1.構建大鼠佐劑性關節(jié)炎模型，左側足底皮下注射弗式完全佐劑（complete Freund’s adjuvant，CFA）100μl，CFA注射后2天，鞘內注射LV-shRNA-IL-33和陰性對照病毒。于術前1天和術后6h、12h、2

6、4h（1天）、2天、3天、4天、7天、10天、14天、21天觀察大鼠行為學變化，記錄機械痛閾和熱痛閾，測量足趾腫脹度。
　　2.使用Western-blot技術評估CFA組大鼠1天、2天、3天、4天、7天、10天、14天、21天脊髓IL-33蛋白的表達改變，檢測CFA+LV-IL-33-RNAi組和CFA+LV-IL-33-NC組第14天、第21天脊髓IL-33蛋白表達的改變。取21天各組大鼠左側踝關節(jié)，HE染色觀察大鼠關節(jié)病理改

7、變。
　　結果：
　　1.相比sham組，CFA大鼠的機械痛閾和熱痛閾明顯下降（P<0.01），而足趾腫脹程度明顯增加（P<0.01）。
　　2.外周炎癥上調了脊髓IL-33蛋白的表達，LV-IL-33-RNAi組第14天和第21天，脊髓IL-33蛋白水平下調，而LV-IL-33-NC組無下調變化。
　　結論：外周炎癥上調了脊髓IL-33蛋白的表達，鞘內注射LV-shRNA-IL-33能下調IL-33蛋白的表達。