定向進化提高短鏈脫氫酶EbSDR8的苯乙酮耐受性.pdf

1、手性醇是合成手性藥物、農(nóng)用化學(xué)品及精細化學(xué)品的重要中間體。生物催化潛手性酮不對稱還原合成手性醇的方法與化學(xué)法相比具有反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少、理論產(chǎn)率高、環(huán)境友好等優(yōu)點，是手性醇綠色合成的一項重要技術(shù)。目前，大部分生物催化劑在不對稱還原潛手性酮的過程中遵循Prelog原則，遵循anti-Prelog原則的生物催化劑相對比較稀缺。而短鏈脫氫酶EbSDR8在不對稱還原苯乙酮的過程中遵循anti-Prelog規(guī)則，產(chǎn)物為R-苯乙醇，但目前有關(guān)該

2、酶催化高濃度苯乙酮不對稱還原的研究尚未開展。因此，本課題首次采用定向進化的方法對該酶進行改造，篩選出在高濃度苯乙酮下催化比活力高的突變體，并對其重組菌的催化條件進行優(yōu)化，以獲得具有工業(yè)化應(yīng)用潛力的重組菌株。
　　利用分子生物學(xué)手段從短穩(wěn)桿菌ZJUY-1401中成功克隆了短鏈脫氫酶基因Ebsdr8，同時成功的實現(xiàn)了其編碼蛋白EbSDR8在E.coli BL21(DE3)中的異源表達，且該EbSDR8可以不對稱還原苯乙酮為R-苯乙醇，

3、遵循anti-Prelog原則。
　　本課題在EbSDR8的晶體結(jié)構(gòu)未曾被報導(dǎo)的前提下，以該EbSDR8基因為模板，采用易錯PCR的手段引入隨機突變以建立合適的突變體文庫，最終確定當(dāng)模板稀釋1000倍，錳離子濃度為0.5mM時所建立的突變體文庫最佳，包含1-2個突變位點;建立了基于顯色反應(yīng)的高通量篩選方法對突變體文庫進行篩選，獲得了突變體M190V。突變體M190V在不對稱還原200mM苯乙酮時的催化比活力比EbSDR8提高了74