基于Tat底物校對(duì)監(jiān)控系統(tǒng)的巴氏醋桿菌乙醇脫氫酶的定向進(jìn)化.pdf

1、醋酸菌在食醋工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中的廣泛應(yīng)用得益于其突出的高產(chǎn)酸、耐酸性能，而以吡咯喹啉醌(PQQ)為輔酶的乙醇脫氫酶(PQQ-ADH)在此過(guò)程中扮演著重要角色，因其能將乙醇氧化生成乙醛，進(jìn)而在乙醛脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化成乙酸。本文以從浙江傳統(tǒng)玫瑰醋中分離得到的巴氏醋桿菌Ab3為出發(fā)菌株，借助Tat表達(dá)體系并融合抗性基因?qū)ζ湟掖济摎涿复髞喕?AdhA)進(jìn)行可溶性表達(dá)的探索和定向進(jìn)化篩選，為周質(zhì)蛋白基因的可溶性表達(dá)及功能篩選提供了方法論?；谏镄?/p>

2、息學(xué)分分析方法，本文首先對(duì)不同醋酸菌中的AdhA進(jìn)行比對(duì)分析，包括信號(hào)肽預(yù)測(cè)，二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)與分析等，闡述了不同醋酸菌中AdhA在序列上以及結(jié)構(gòu)上的區(qū)別，同時(shí)指出可能且容易發(fā)生突變的影響AdhA活性的位點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建AdhA的Tat-bla表達(dá)體系，結(jié)合易錯(cuò)PCR的方法對(duì)巴氏醋桿菌AdhA進(jìn)行了定向進(jìn)化。
　　生物信息學(xué)結(jié)果表明，不同醋酸菌的AdhA上均存在一段含有雙精氨酸基序S-R-R-x-F-L-K的獨(dú)特信號(hào)肽，

3、能夠被細(xì)菌Tat表達(dá)系統(tǒng)識(shí)別，從而實(shí)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。通過(guò)AdhA的氨基酸序列的比對(duì)及每個(gè)氨基酸位點(diǎn)的剖析可知，在巴氏醋桿菌Ab3的AdhA的氨基酸序列中，與高產(chǎn)酸、耐酸的Komagataeibacter相比較，Ala30Thr、Val31Met、Pro32Ala、Ala33Ser、Asp36Asp、Glu43Glu、Glu53Gly、Lys262Gln、Pro266Pro、Lys267Thr、Ser289Ala、Ile311Lys、Gln3

4、93Val、Leu402Lys、Lys457Thr、Glu508Ala、Thr509Glu、Val510Ala、Trp511Trp、Gly559Gly、Asp639Asp、Met662Val、Thr697Gly、Asn731Gly這些位點(diǎn)的改變可能會(huì)引起其二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，預(yù)示著ADH的活性與這些位點(diǎn)有關(guān)，并進(jìn)而影響醋酸菌的耐酸性。
　　在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，成功克隆了adhA基因及氨芐抗性基因，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pADH-Bla，

5、實(shí)現(xiàn)了adhA基因在大腸桿菌周質(zhì)空間的可溶性表達(dá)和定向進(jìn)化。利用大腸桿菌Tat表達(dá)系統(tǒng)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，選用易錯(cuò)PCR的方法對(duì)adhA基因定向進(jìn)化，抗性平板篩選出氨芐抗性能力提高的突變菌株M14，M21，M28，M44，M59和M60。M14與M21的adhA基因有3個(gè)突變位點(diǎn)A158G，C290G，A784C，對(duì)應(yīng)的氨基酸突變?yōu)镚lu53Gly，Ala97Gly，Lys262Gln。M28與M60的adhA基因的突變位點(diǎn)為A158G，C12

6、04G，對(duì)應(yīng)的氨基酸突變?yōu)镚lu53Gly，Leu402Lys。其中M14和M28有共同的突變位點(diǎn)A158G。M44的adhA基因共有5個(gè)突變位點(diǎn)，分別為A129G，G643T，A1523C，C1677A和A1984G，對(duì)應(yīng)的氨基酸突變?yōu)镚lu43Glu，Ala215S er，Glu508Ala，Gly559Gly和Met662Val。M59的adhA基因的突變位點(diǎn)為T(mén)473A，T1529C，對(duì)應(yīng)的氨基酸突變?yōu)镻he158Tyr，Val