DNA凝聚過程中溶劑效應(yīng)的單分子研究.pdf

1、DNA的凝聚是分子生物學(xué)的核心之一，而單分子操縱技術(shù)在分子生物學(xué)的發(fā)展中提供重要的手段，本文主要是采用單分子磁鑷技術(shù)(MT)與原子力顯微鏡技術(shù)(AFM)，對(duì)DNA的凝聚過程的溶劑效應(yīng)進(jìn)行研究。主要研究內(nèi)容包括:
　　1.利用原子力顯微鏡技術(shù)(AFM)，系統(tǒng)地研究了由乙醇與多價(jià)離子(hexammine cobalt(Ⅲ)[Co(NH3)6<'3+>])協(xié)同作用導(dǎo)致的lambda-DNA凝聚現(xiàn)象。單獨(dú)測得三價(jià)Co(NH3)6<'3+>

2、的臨界凝聚濃度大約是10μM，乙醇的臨界凝聚濃度大約是15％(v/v)。若三價(jià)離子Co(NH3)6<'3+>的濃度大于400μM時(shí)，可以觀察到DNA的解凝聚現(xiàn)象。在DNA溶液中同時(shí)36加入乙醇(12％)與Co(NH3)6<'3+>(8μM)，當(dāng)其濃度各低于臨界值時(shí)，也可觀察到凝聚現(xiàn)象，說明乙醇與Co(NH3)6<'3+>對(duì)DNA的凝聚有協(xié)同作用。而且在協(xié)同作用下，可以觀察到典型的36圓環(huán)結(jié)構(gòu)(toroids)。其中解凝聚現(xiàn)象可能運(yùn)用電荷

3、逆轉(zhuǎn)與離子釋放機(jī)制來解釋。
　　2.通過AFM與MT的技術(shù)，研究酒精導(dǎo)致的DNA凝聚。酒精一般被用作提純DNA的沉淀劑，我們通過MT與 AFM技術(shù)研究酒精導(dǎo)致的單分子 DNA凝聚。首次證明酒精引起的DNA塌縮的中間亞穩(wěn)球拍態(tài)的存在。對(duì)于凝聚力的測量，甚至在50％酒精濃度都不到0.2pN，這個(gè)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于多價(jià)離子與表面活性劑。還證明了酒精導(dǎo)致的DNA形態(tài)的B-A轉(zhuǎn)變，發(fā)現(xiàn)DNA的A形態(tài)的彈性模量比B形態(tài)的要大。與多價(jià)離子相比，酒精導(dǎo)致

4、DNA凝聚的拉伸實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)了不同的特性，其拉伸曲線的步長范圍比較大，從幾十納米到幾微米的范圍都有，與多價(jià)離子相對(duì)統(tǒng)一的200nm的步矩形成對(duì)比。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，隨著酒精濃度的增加，DNA的持久長度成單調(diào)減小的趨勢(shì)。在弱溶劑里，由于DNA片段之間的弱相互作用引起的DNA的凝聚形態(tài)，多是一些不規(guī)則球拍組成的松散花狀的結(jié)構(gòu)。通過AFM成像進(jìn)一步證實(shí)這些現(xiàn)象與分析結(jié)果。得出結(jié)論，在酒精導(dǎo)致的DNA凝聚中溶劑排斥效應(yīng)比電荷中和效應(yīng)更占據(jù)主導(dǎo)地位。

5、r>　　3.多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的內(nèi)切酶與 DNA相互作用的方式有很多，其中通過結(jié)合成環(huán)狀的方式在許多基礎(chǔ)生物化學(xué)的過程中起著很重要的作用。限制性內(nèi)切酶 BspMI必須綁定 DNA上面兩個(gè)有效的識(shí)別位點(diǎn)才具有有效的活性，這是研究這種成環(huán)相互作用的有用模型。在實(shí)驗(yàn)中Ca2+代替正常的內(nèi)切酶輔助因子 Mg2+，限制了內(nèi)切酶的切割作用，導(dǎo)致內(nèi)切酶與 DNA的結(jié)合，而且這種內(nèi)切酶一般是通過四聚體的形式與 DNA的一個(gè)位點(diǎn)結(jié)合或者通過一個(gè)四聚體結(jié)合兩個(gè)位