多抗用于快速比較未純化酶-突變體的比活性.pdf

1、酶的分子工程是生物技術(shù)領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)，目前主要包括合理設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化。突變體的合理設(shè)計(jì)需要建立在了解酶的活性-構(gòu)效關(guān)系的基礎(chǔ)上，不僅在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性，而且需要巨大的計(jì)算量；因此，通過建立起始酶突變體文庫的定向進(jìn)化更常用。理論上來講，純化后突變體比活性的比較可以用于識(shí)別陽性突變體，但是突變體數(shù)量巨大，純化過程的成本和時(shí)間消耗極大地阻礙了篩選效率。在誘導(dǎo)表達(dá)后，希望借助細(xì)胞裂解液中酶與突變體比活性的比較識(shí)別陽性突變體，但不同單克隆誘導(dǎo)表達(dá)

2、豐度差異巨大。顯然，酶的定向進(jìn)化需要能可靠識(shí)別陽性突變體的新策略。
　　在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用固定在微板孔的抗6His單抗與羧酸酯酶（Est1）及其突變體M326L，以及使用Ni2+-NTA磁性顆粒與大腸桿菌堿性磷酸酶（ECAP）及其突變體R168K，已經(jīng)被證明可有效預(yù)測(cè)Vs以識(shí)別陽性突變體，該方法已獲得專利。不幸的是，微孔板固定單抗其應(yīng)用范圍窄，親和力不夠，抗His標(biāo)簽的單抗適合于預(yù)測(cè)6His標(biāo)記Est1/突變體的Vs，而對(duì)6H

3、is標(biāo)記的ECAP和6His標(biāo)記的銅綠假單胞菌芳香族硫酸酯酶（PAAS）都是無效的；此外，Ni2+-NTA磁性顆粒會(huì)抑制PAAS/突變體酶的活性，且抑制作用對(duì)不同突變體不一致，其對(duì)細(xì)胞裂解液中酶豐度的要求也較高。因此，在前期已有方法學(xué)的基礎(chǔ)上，考慮將多抗作親和吸附劑，其結(jié)合反應(yīng)的親和力、適用范圍、成本、耗時(shí)等方面均有所改進(jìn)。
　　1.微孔板固定硫酸銨沉淀粗制多抗比較未純化酶/突變體的Vs
　　重組表達(dá)并親和純化6His-EC

4、AP及6His-PAAS使其純度達(dá)85%以上，生理鹽水稀釋純樣品并與弗氏免疫佐劑乳化作為免疫原，注射5次取全血分離血清得相應(yīng)抗血清，將抗ECAP兔抗血清用33%的硫酸銨沉淀得粗制多抗，再用pH6.0的MES緩沖液在DEAE-纖維素柱中純化得到純化多抗。在前期研究基礎(chǔ)上，將粗制多抗固定在96孔ELISA板中，ECAP及突變體R168K誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)胞裂解液作為樣品，測(cè)得活性及蛋白濃度后，再應(yīng)用響應(yīng)曲線擬合的方法對(duì)吸附的酶/突變體進(jìn)行定量活

5、性比較。4.0ml培養(yǎng)體積誘導(dǎo)表達(dá)后的樣品裂解液中，ECAP的活性達(dá)19.7±5.7 KU/g（n=12），而 R168K的活性為36.7±15.1 KU/g（n=12）。其活性比率比親和純化兩次后用傳統(tǒng)方法測(cè)得比率大得多（P＜0.01）。使用相同批次的ECAP粗制多抗，通過Matalab擬合ECAP與R168K響應(yīng)曲線估計(jì)Vs的比率為1.6±0.1（n=2），通過回歸分析得到的比率為1.5±0.1（n=2）。通過兩種數(shù)據(jù)處理方法，EC

6、AP與突變體R168K關(guān)于Vs比率彼此一致，并與親和純化后用傳統(tǒng)方法測(cè)定或使用Ni2+-NTA的預(yù)測(cè)Vs的比率一致，支持了多抗作為親和吸附劑預(yù)測(cè)Vs可靠性。
　　2.磁珠固定純化多抗預(yù)測(cè)比較未純化酶/突變體的Vs
　　抗ECAP或PAAS抗血清通過33%硫酸銨沉淀和DEAE-纖維素柱得到純化多抗；磁珠羧基活化后固定純化多抗備用；
　　在固定有多抗的磁珠中加入對(duì)應(yīng)酶進(jìn)行免疫反應(yīng)，洗去未結(jié)合酶，加入對(duì)硝基苯酚衍生物類底物顯

7、色，強(qiáng)堿終止反應(yīng)后讀取405 nm處吸收增量表示吸附酶活性，對(duì)反應(yīng)體系中加入的總蛋白量可繪制響應(yīng)曲線，據(jù)吸附反應(yīng)的數(shù)學(xué)模型擬合響應(yīng)曲線預(yù)測(cè)Vs。假定吸附酶與游離酶比活性相同，每克多抗磁珠吸附酶容量約2.0 mg。R168K較ECAP的比活性提高約50%，2.5μg多抗磁珠反應(yīng)10 min用于預(yù)測(cè)Vs；PAAS與活性僅低于其25%的突變體G138S，需要10μg多抗磁珠反應(yīng)20 min預(yù)測(cè)Vs，而ECAP的酶活力是PAAS的70倍。因此，

8、只要被吸附酶活性能在儀器的檢測(cè)限內(nèi)可靠測(cè)定，用磁珠能識(shí)別活性提高20%以上的弱陽性突變體，故磁珠固定多抗的方法適于預(yù)測(cè)Vs以識(shí)別弱陽性突變體。
　　3.免疫比濁法預(yù)測(cè)未純化酶/突變體比活性
　　使用PAAS和芽孢桿菌致病尿酸酶（BFU）及其突變體作為模型，測(cè)試了基于蛋白層面的免疫比濁（ITA）測(cè)定細(xì)胞裂解液中酶及突變體的量以獲得其比活性。以0.18mL含有0.75mg抗血清的反應(yīng)緩沖液與0.02mL梯度稀釋樣品液為固定反應(yīng)體

9、系，使用酶標(biāo)儀測(cè)定340nm與700nm處的吸光度值。根據(jù)ITA的校準(zhǔn)曲線在0.4至3.0μg范圍內(nèi)對(duì)PAAS或BFU進(jìn)行定量。在相同誘導(dǎo)表達(dá)條件下，批間重復(fù)時(shí)細(xì)胞裂解液中PAAS/突變體的表達(dá)豐度基本一致，保證了細(xì)胞裂解液中酶/突變體對(duì)相同抗血清存在一致的免疫反應(yīng)性；BFU/突變體的表達(dá)豐度與PAAS呈現(xiàn)相同趨勢(shì)。細(xì)胞裂解液中PAAS/突變體或BFU/突變體通過ITA后得到免疫比活性的比值與純化后常規(guī)測(cè)定方法測(cè)出的比活性比值高度一致。