基于系統(tǒng)藥理學(xué)方法研究大黃酸治療腎小管間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制.pdf

1、腎小管間質(zhì)纖維化（Tubulointerstitial fibrosis，TIF），是各種慢性腎病進(jìn)展到終末期的共同病理過(guò)程，其病理進(jìn)程是在時(shí)間和空間尺度上不斷累積的一個(gè)過(guò)程。目前，對(duì)腎臟纖維化病程的評(píng)估主要采取創(chuàng)傷的腎活檢，臨床上也尚無(wú)針對(duì)腎小管間質(zhì)纖維化的特效藥物。大黃酸具有明顯的抗纖維化作用，對(duì)腎小管間質(zhì)纖維化的治療是從分子水平出發(fā)，反映到細(xì)胞、組織和器官的一種調(diào)控。作為一個(gè)多靶點(diǎn)的成分，大黃酸作用靶點(diǎn)形成的生物網(wǎng)絡(luò)是復(fù)雜的。因此

2、，如何動(dòng)態(tài)模擬該疾病的發(fā)生和發(fā)展，并且系統(tǒng)地研究大黃酸作用于生物網(wǎng)絡(luò)在不同尺度上的聯(lián)系對(duì)于腎小管間質(zhì)纖維化的治療具有重要意義。系統(tǒng)藥理學(xué)能夠從時(shí)間到空間系統(tǒng)地建立一個(gè)藥物對(duì)機(jī)體的作用在不同尺度之間的相互關(guān)聯(lián)。運(yùn)用系統(tǒng)藥理學(xué)去研究藥物的機(jī)制往往涉及到藥物靶點(diǎn)的鑒別、疾病網(wǎng)絡(luò)模型的建立和分析以及多尺度系統(tǒng)的整合等技術(shù)。本論文運(yùn)用系統(tǒng)藥理學(xué)的方法研究大黃酸治療腎小管間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。分為以下兩個(gè)部分：
　　本文第一部分應(yīng)用正（反）分

3、子對(duì)接、網(wǎng)絡(luò)分析等虛擬方法和表面等離子共振（Surface plasmon resonance，SPR）實(shí)驗(yàn)方法識(shí)別了大黃酸的新靶點(diǎn)，結(jié)合基因富集分析提出了大黃酸可能的藥物作用機(jī)制。首先，從ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)下載大黃酸配體的三維分子結(jié)構(gòu)，應(yīng)用 PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行反向分子對(duì)接，初步篩選大黃酸潛在靶點(diǎn)；在此基礎(chǔ)上，以陽(yáng)性藥物為對(duì)照，執(zhí)行正向分子分子對(duì)接，進(jìn)一步篩選大黃酸潛在靶點(diǎn)。同時(shí)收集整合STITCH數(shù)據(jù)庫(kù)的大黃酸已知靶點(diǎn)。用C

4、ytoscape軟件構(gòu)建大黃酸作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。將得到的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行擴(kuò)展，計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，據(jù)此篩選大黃酸候選靶點(diǎn)。然后，通過(guò) SPR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其中一個(gè)未被文獻(xiàn)報(bào)道的候選靶點(diǎn) LCK。最后，對(duì)上述靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，構(gòu)建富集通路整合網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果顯示，LCK、HSP90AA1、RAB5A、EGFR、CDK2、CDK6、GSK3B、p38和 JNK這9個(gè)大黃酸候選靶點(diǎn)被富集。網(wǎng)絡(luò)分析顯示，大黃酸的治療作用是多條信號(hào)通路協(xié)同和綜合的結(jié)果，多個(gè)靶點(diǎn)的擾動(dòng)賦

5、予了大黃酸多種有效的藥理活性。
　　在論文的第二部分，通過(guò)建立多個(gè)尺度的數(shù)學(xué)模型，動(dòng)態(tài)模擬腎小管間質(zhì)纖維化疾病進(jìn)程，并通過(guò)大黃酸干預(yù)模擬，進(jìn)一步揭示大黃酸治療腎小管間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。首先，分別構(gòu)建了細(xì)胞和分子兩個(gè)尺度上的模型。在細(xì)胞水平上，實(shí)驗(yàn)采用基于主體的模型（Agent-based model，ABM），通過(guò)規(guī)定其細(xì)胞之間相互作用的規(guī)則，模擬1 mm×1 mm的二維腎皮質(zhì)部分。在分子水平上，構(gòu)建了細(xì)胞內(nèi)的分子網(wǎng)絡(luò)常微分方程

6、（Ordinary differential equation，ODE）模型和細(xì)胞外的擴(kuò)散和降解偏微分方程（Partial differential equation，PDE）模型，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)模擬單個(gè)細(xì)胞內(nèi)大分子的變化。然后，通過(guò)兩個(gè)水平之間相關(guān)分子的信息交互，連接這兩個(gè)尺度的模型，從而實(shí)現(xiàn)從系統(tǒng)的水平去模擬腎小管間質(zhì)纖維化。隨后，通過(guò)大黃酸干預(yù)，從多個(gè)尺度觀察其對(duì)疾病的作用。結(jié)果顯示，在低濃度TGF-β（1 ng/mL）的刺激下，模型未

7、出現(xiàn)纖維化癥狀，腎小管保存完整，成纖維細(xì)胞也處于正常數(shù)量，沒(méi)有肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，沒(méi)有巨噬細(xì)胞募集。而在高濃度TGF-β（10 ng/mL）的刺激下，模型大面積呈現(xiàn)纖維化瘢痕，腎小管完全破壞，小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，巨噬細(xì)胞隨時(shí)間逐漸增加。大黃酸干預(yù)能明顯減緩在高濃度 TGF-β刺激下的腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)展