環(huán)孢素A治療博來霉素誘導的肺間質(zhì)纖維化及其機制的研究.pdf

1、背景：
　　間質(zhì)性肺病(interstitial lung disease，ILD或DILD，diffuse interstitial lung disease)是以彌漫性肺實質(zhì)、肺泡炎癥和間質(zhì)纖維化為基本病理病變，以活動性呼吸困難、X線胸片彌漫性浸潤陰影、限制性通氣障礙、彌散功能(肺一氧化碳彌散量，DLCO)降低和低氧血癥為臨床表現(xiàn)的一類疾病。ILD中一部分患者繼發(fā)于類風濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多肌炎/皮肌炎、強

2、直性脊柱炎及混合結(jié)締組織病，臨床上也很常見。間質(zhì)纖維化一旦形成，將不可逆地導致嚴重的甚至威脅生命的呼吸循環(huán)功能障礙。因此，加深對肺間質(zhì)纖維化機制，尤其是對其病程早期階段的認識，是該病發(fā)病機制和治療研究亟待解決的問題。
　　CD147，又稱為細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導因子（extracellular matrix metaloproteinase inducer，EMMPRIN），屬于免疫球蛋白超家族，在體內(nèi)廣泛表達。Cyclophi

3、lin A（CyPA）是存在于多種細胞內(nèi)的細胞溶質(zhì)蛋白，CD147的配體，環(huán)孢素A（cyclosporine A，CsA）作用的靶分子。CsA是一種強效的免疫抑制劑，特異作用于淋巴細胞，臨床用于預防和治療同種異體器官移植或骨髓移植的排斥反應或移植物抗宿主反應，也用于經(jīng)其他免疫抑制劑治療無效的狼瘡腎炎、難治性腎病綜合征等自身免疫性疾病。
　　本研究所以往研究報道，在炎癥病灶中高表達CD147分子的配體CyPA可趨化炎細胞在關(guān)節(jié)病灶中

4、聚集，通過與CD147相互作用在RA關(guān)節(jié)內(nèi)、外病變的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用，CsA對上述病理過程有抑制作用。為了探明CyPA-CD147在肺間質(zhì)性病變中是否也存在相似的作用和機制，本實驗在前期工作的基礎(chǔ)上，建立肺間質(zhì)纖維化小鼠模型，研究其病程中的細胞與分子基礎(chǔ)，并用CsA進行早期干預治療，初步探討CD147-CyPA在肺間質(zhì)纖維化發(fā)病中的作用。
　　目的：
　　建立肺間質(zhì)纖維化小鼠模型，觀察模型小鼠肺部炎性細胞浸潤及膠原纖

5、維沉積的病理過程，探索其細胞與分子基礎(chǔ)。用CsA治療模型小鼠肺間質(zhì)炎癥及纖維化，探討其可能的機制。
　　方法和結(jié)果：
　　1、肺間質(zhì)纖維化小鼠模型及研究體系的建立
　　1.1、肺間質(zhì)纖維化小鼠模型的建立
　　雌性，9～11周齡C57BL/6小鼠按照隨機數(shù)字表分為3組：模型組（BLM組）、鹽水對照組（saline組）和空白對照組（NC組），每組各24只。以5.0mg/kg（濃度2.0mg/ml）建立肺間質(zhì)纖維化小鼠

6、模型，saline組在相同條件下向氣管內(nèi)注入同體積生理鹽水。
　　1.2、檢測及研究
　　于給藥第4d、7d、14d分批取材，每次每組8只。實驗小鼠均經(jīng)眼球取血法取外周血500μL，肝素鈉抗凝。計數(shù)白細胞總數(shù)，流式細胞術(shù)檢測CD4+T淋巴細胞、CD14+單核細胞和CD19+B淋巴細胞數(shù)量比例。剪取小鼠左上肺組織塊置100mL/L福爾馬林固定24h，經(jīng)脫水、石蠟包埋后，制作石蠟切片（切片厚度3μm），行HE及Masson染色。

7、采用Ashcroft評分標準評價BLM組小鼠肺組織纖維化情況。細胞計數(shù)板計數(shù)BALF細胞總數(shù)，細胞涂片行Giemsa染色。
　　1.3、結(jié)果
　　1.3.1、外周血及BALF細胞分析
　　BLM組小鼠外周血白細胞總數(shù)明顯升高，在造模后第7d達高峰，為（10.96±0.35）×109/L，顯著高于同一時間點saline組（P<0.01）。流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)CD14+單核細胞在第4～14d的比例均數(shù)分別為5.94％、5.8

8、6％、4.76％，均較saline組顯著增高。CD19+B淋巴細胞僅在造模第7d、14d較saline組升高明顯。各時間點NC組與saline組白細胞計數(shù)、CD14+單核細胞及CD19+B淋巴細胞相比均未見顯著差異。BLM組第4～14d時BALF細胞總數(shù)分別為（35.2±10.10）×106/肺、（23.1±15.52）×106/肺和（14.89±1.33）×106/肺，均較同一時間點saline組顯著升高。細胞分類計數(shù)顯示，BLM組B

9、ALF中升高的主要為淋巴細胞（7d：104.90/HP），至14d時仍維持在較高水平。其次為單核-巨噬細胞，中性粒細胞在早期（4d，7d）升高明顯。各時間點NC組與saline組BALF細胞計數(shù)、單核-巨噬細胞、淋巴細胞及中性粒細胞相比均未見顯著差異。
　　1.3.2、肺組織病理觀察
　　肺組織病理觀察顯示，BLM組自實驗第4d開始肺泡間隔逐漸增寬，間質(zhì)內(nèi)細胞浸潤逐漸增多，以淋巴細胞為主，并有單核-巨噬細胞及中性粒細胞的浸潤

10、。間質(zhì)內(nèi)及小支氣管周圍成纖維細胞自實驗第7d開始聚集逐漸增多，膠原纖維沉積增多，第14d時見肺組織結(jié)構(gòu)破壞，瘢痕形成。纖維化評分在第4d時平均為1.5分，隨著時間延長而增加，至第14d時為6.92分，纖維化明顯。Saline組及NC組各時間點肺組織均未見明顯炎癥及纖維化改變。
　　2、環(huán)孢素A治療博來霉素誘導小鼠肺間質(zhì)纖維化的研究
　　2.1、肺間質(zhì)纖維化小鼠模型的建立及治療
　　雌性，9～11周齡C57BL/6小鼠按

11、照隨機數(shù)字表分為4組：CsA30mg治療組、CsA50mg治療組、治療對照組（BLM+saline組）和BLM組，每組各24只。以5.0mg/kg（濃度2.0mg/ml）建立肺間質(zhì)纖維化小鼠模型。于造模次日起腹腔注射給藥，治療組用CsA（30mg/kg，50mg/kg），溶于0.15ml生理鹽水中，治療對照組用同體積的生理鹽水，每日1次。BLM組不予處理。
　　2.2、檢測及研究
　　于連續(xù)給藥第4d、7d、14d分批取材，

12、每次每組8只。實驗小鼠均經(jīng)眼球取血法取外周血500μL，肝素鈉抗凝。計數(shù)白細胞總數(shù)，流式檢測CD4+T淋巴細胞、CD14+單核細胞和CD19+B淋巴細胞比例。剪取小鼠左上肺組織塊置100mL/L福爾馬林固定24h，經(jīng)脫水、石蠟包埋后，制作石蠟切片（切片厚度3μm），行HE及Masson染色。免疫組化檢測CD147表達情況。采用Ashcroft評分標準評價BLM組小鼠肺組織纖維化情況。細胞計數(shù)板計數(shù)BALF細胞總數(shù)，細胞涂片Giemsa染

13、色。
　　2.3、結(jié)果
　　2.3.1、外周血及BALF細胞分析
　　CsA治療后，實驗小鼠外周血白細胞總數(shù)在CsA30mg組為（5.11±0.25）×109/L，CsA50mg組為(5.63±0.34)×109/L，較BLM組（7.07±0.51）×109/L明顯降低（P＜0.01）；CsA治療組各時間點CD14+單核細胞百分率均數(shù)顯著降低，以4d時最為明顯（＜3.2％）；CD19+B淋巴細胞比例在4d時變化不明顯，

14、7d、14d時其百分率均數(shù)分別為39.95％和37.22％，均顯著低于同一時間點BLM組（53.27％，P＜0.01）。各時間點BLM組和治療對照組白細胞計數(shù)、CD14+單核細胞及CD19+B淋巴細胞百分率均數(shù)相比均未見明顯差異。CsA治療組小鼠BALF總數(shù)在用藥初期即明顯減少，4d時30mg組BALF細胞總數(shù)為（4.47±0.88）×105/肺，50mg組為（14.67±0.26）×105/肺，較之BLM組(35.20±1.10)×1

15、06/肺顯著降低（P＜0.01）；CsA治療組各型細胞數(shù)量亦明顯下降，其中淋巴細胞下降最為明顯，每高倍鏡視野可見（16.56±6.44，25.29±14.16；vsBLM，P＜0.01），并持續(xù)低水平至第14d（17.44±8.34；10.58±3.61），病變明顯改善。各組間中性粒細胞的比較在早期（7d、14d）有顯著統(tǒng)計學差異。各時間點BLM組和治療對照組BALF細胞計數(shù)、淋巴細胞、單核-巨噬細胞及中性粒細胞相比均未見顯著差異。

16、r>　　2.3.2、肺組織病理觀察
　　CsA治療組肺間質(zhì)炎癥明顯減輕，且50mg組治療效果明顯好于30mg組，間質(zhì)內(nèi)及小支氣管周圍未見成纖維細胞明顯聚集及膠原纖維沉積增多。纖維化評分均小于2.0，提示肺部纖維化情況改善。治療對照組肺部可見明顯炎癥及纖維化改變，與BLM組相比無顯著差異。
　　2.3.3、肺組織CD147的表達
　　BLM組小鼠肺組織內(nèi)浸潤的單核-巨噬細胞、中性粒細胞和淋巴細胞均高表達CD147分子，C

17、sA治療組肺內(nèi)表達CD147的細胞明顯減少，但兩劑量組間未見明顯差異。
　　結(jié)論：
　　本文成功建立了肺間質(zhì)纖維化小鼠模型及其研究體系，并用CsA進行治療研究。證明博來霉素誘導的肺間質(zhì)纖維化發(fā)病早期表現(xiàn)為全身和肺部大量炎性細胞聚集，啟動了炎癥反應，隨著疾病發(fā)展，將導致晚期肺損傷和纖維化的發(fā)生。CsA早期應用不僅可抑制炎癥，而且可抑制疾病發(fā)展，其可能的機制是通過阻斷CD147-CyPA相互作用，減少淋巴細胞、中性粒細胞及單核-