Ⅱb類細(xì)菌素PlnJ和PlnK的異源表達(dá)和抗菌活性研究.pdf

1、細(xì)菌素是人類研究較為深入的微生物防御物質(zhì)，具有種類多樣，來源豐富，無毒高效等特點(diǎn)。隨著化學(xué)防腐劑的泛濫和抗生素耐藥病原菌的出現(xiàn)，安全高效的細(xì)菌素在食品防腐、醫(yī)療保健以及動(dòng)物飼料行業(yè)具有巨大的潛力。到目前為止，只有nisin一種細(xì)菌素被商業(yè)化應(yīng)用于食品防腐行業(yè)，且存在抑菌譜窄，只能抑制部分革蘭氏陽性菌的缺陷。因此開發(fā)其他廣域抑菌的細(xì)菌素就非常有必要。
　　本文的實(shí)驗(yàn)對(duì)象是Ⅱb類細(xì)菌素PlnJ/K，其中多肽PlnJ含有25個(gè)氨基酸，多

2、肽PlnK含有32個(gè)氨基酸。當(dāng)這兩個(gè)不同的多肽協(xié)同作用時(shí)，抑菌活性將明顯增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)室篩選得到一株具有廣譜抗菌性的植物乳桿菌ZJ316，在其全基因組序列中的植物乳桿菌素基因簇中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素基因plnJ和plnK，并在大腸桿菌中成功地表達(dá)這兩個(gè)基因。通過一系列的分離純化得到目標(biāo)蛋白，并對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行了初步的抗菌活性研究。具體內(nèi)容如下:
　　1)設(shè)計(jì)plnJ和plnK基因合成序列，在兩個(gè)基因的5'端添加一個(gè)腸激酶酶切位點(diǎn)，目的是為了表達(dá)

3、目標(biāo)蛋白后，用腸激酶酶切，能得到未經(jīng)任何修飾的成熟肽PlnJ和PlnK。
　　2)設(shè)計(jì)引物，對(duì)合成基因plnJ和plnK進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物與表達(dá)載體pET-32a進(jìn)行KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切，構(gòu)建pET-32a-plnJ和pET-32a-plnK重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL21(DE3)中，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE驗(yàn)證重組蛋白pET-32a-PlnJ和pET-32a-PlnK被順利誘導(dǎo)。

4、　　3)為減少包涵體的產(chǎn)生，將重組表達(dá)菌株BL21-pET-32a-plnJ和BL21-pET-32a-plnK在1 mM IPTG，16℃，160 rpm的條件下過夜誘導(dǎo)表達(dá)，菌體超聲破碎后離心收集上清。
　　4)超聲破碎上清為含有組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白pET-32a-PlnJ和pET-32a-PlnK的粗提液，通過鎳柱吸附融合蛋白，利用咪唑與組氨酸標(biāo)簽競(jìng)爭鎳柱的結(jié)合位點(diǎn)，洗脫得到的融合蛋白即為純度較高的重組蛋白，脫鹽濃縮后，利用

5、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定重組蛋白的濃度，分別為880μg/mL和720μg/mL。腸激酶酶切得到兩種蛋白PlnJ和PlnK，分子量的大小分別為2.9 kDa和3.5 kDa，用10 kDa超濾離心管離心收集分子量小的蛋白，即濾液中含有目標(biāo)蛋白PlnJ和PlnK。
　　5)對(duì)分離得到的目標(biāo)蛋白PlnJ和PnK進(jìn)行抑菌活性研究，指示菌為大腸桿菌和單增李斯特菌，采用牛津杯雙層平板抑菌法和96孔板抑菌法。在雙層平板抑菌法中，單獨(dú)的Pl