微生物來源36家族α-半乳糖苷酶的基因克隆與性質(zhì)研究.pdf

1、α-半乳糖苷酶(α-galactosidase，α-D-galactosidegalactohydrolase；EC3.2.1.22)也稱蜜二糖酶，是一種外切糖苷酶，催化移除不同底物中α-連接的末端非還原性D-半乳糖。α-半乳糖苷酶在醫(yī)療、食品、化工及飼料等方面有著廣泛的應(yīng)用。在飼料工業(yè)中。α-半乳糖苷酶添加劑是去除豆粕中α-半乳糖苷寡糖類抗?fàn)I養(yǎng)因子的首選方法。飼用α-半乳糖苷酶的生產(chǎn)目前尚未形成產(chǎn)業(yè)化，其中，性質(zhì)優(yōu)良的α-半乳糖苷酶的

2、發(fā)掘是一個(gè)亟待解決的關(guān)鍵問題。 本研究通過對(duì)菌種新穎性和產(chǎn)酶能力的評(píng)估，確定了根霉F78(Rhizopussp.F78)、赤霉F75(Gibberellasp.F75)、鏈霉菌(Streptomycessp.)S9和S27及耶爾森氏菌(YersiniapestisbiovarMicrotusstr.91001)為本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。根霉和赤霉都是重要的工業(yè)菌種，但未見這2個(gè)屬中α-半乳糖苷酶基因克隆與表達(dá)的相關(guān)報(bào)道。鏈霉菌S9和

3、S27是分離自火焰山的2個(gè)菌株，生長條件特殊。 利用生物信息學(xué)的方法，對(duì)微生物來源糖苷水解酶36家族的α-半乳糖苷酶序列進(jìn)行比對(duì)和分析，總結(jié)該家族的酶蛋白在分子最大小上的差異，進(jìn)行分類、分析和簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)，通過簡(jiǎn)并PCR擴(kuò)增得到來源于研究菌株中編碼α-半乳糖苷酶的基因片斷，再結(jié)合不同的基因克隆方法最終獲得這些基因的全序列。因此，基于這對(duì)保守基序設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物可以有效的擴(kuò)增到糖苷水解酶36家族的α-半乳糖苷酶基因。 對(duì)

4、5個(gè)實(shí)驗(yàn)菌株中獲得的α-半乳糖苷酶基因進(jìn)行BLAST比對(duì)，分析其編碼的氨基酸序列與已報(bào)道的α-半乳糖苷酶的氨基酸序列的相似性。結(jié)果表明來源于根霉F78的α-半乳糖苷酶Aga-F78最高相似性為45％，赤霉F75的α-半乳糖苷酶Aga-F75最高相似性為69％，鏈霉菌S9的α-半乳糖苷酶Aga-S9最高相似性為36％，鏈霉菌S27的α-半乳糖苷酶Aga-S27最高相似性為55％，耶爾森氏菌的α-半乳糖苷酶Aga-Y最高相似性為57％，而5

5、個(gè)酶相互之間的相似性介于25-40％。因此，這5個(gè)α-半乳糖苷酶基因均具有很高的新穎性。 5個(gè)α-半乳糖苷酶基因均在大腸桿菌中異源表達(dá)，并驗(yàn)證其基因功能，酶純化后進(jìn)行了詳細(xì)的酶學(xué)性質(zhì)研究。5個(gè)α-半乳糖苷酶的性質(zhì)比較表明，真菌來源的α-半乳糖苷酶最適pH值偏酸性，在4.0-5.0間，而細(xì)菌來源的則在7.0-7.5的中性范圍內(nèi)；溫度特性上，真菌來源的α-半乳糖苷酶最適溫度在50-60℃，細(xì)菌來源的在35-40℃，Aga-F75-

6、H、Aga-F78-H、Aga-S27-H熱穩(wěn)定性較好；Aga-F75-H和Aga-F78-H對(duì)多種蛋白酶有良好的抗性；Aga-Y-H具有一定適冷酶特性，這在其它α-半乳糖苷酶的研究中還未見報(bào)道。因此，獲得的這些性質(zhì)各異的α-半乳糖苷酶，不僅具有在不同領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，也為研究其結(jié)構(gòu)和功能提供了良好的材料。 飼料添加劑中，α-半乳糖苷酶常需要與蛋白酶共同作用，以提高飼料中營養(yǎng)物的利用率。另外，酶蛋白對(duì)胃腸道內(nèi)蛋白酶的抗性，可

7、以延長其作用時(shí)間，提高其利用效率。所獲得的α-半乳糖苷酶與胰蛋白酶共作用降解豆粕的試驗(yàn)顯示，其中4種酶單獨(dú)作用時(shí)都可較大幅度提高半乳糖的含量。Aga-F75-H、Aga-F78-H和Aga-S27-H與胰蛋白酶共作用不影響α-半乳糖苷酶的降解能力。對(duì)于Aga-F75-H，單獨(dú)作用時(shí)使半乳糖的含量增加了82.42倍，添加胰蛋白酶后降解量又進(jìn)一步增加了約36％。這些酶學(xué)性質(zhì)表明Aga-F75-H、Aga-F78-H和Aga-S27-H，特別