α-半乳糖苷酶高產(chǎn)菌株的篩選及其基因的克隆、表達(dá)、純化和性質(zhì)研究.pdf

1、α-半乳糖苷酶(α-galactosidase,α-D-galactoside galactohydLrolase;EC3.2.1.22)也稱(chēng)蜜二糖酶,屬于外切糖苷酶類(lèi)?？梢蕴禺愋源呋瞥煌孜镏笑?末端連接的非還原性D-半乳糖。α-半乳糖苷酶廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物中。而微生物種類(lèi)繁多、分布廣泛、適應(yīng)性強(qiáng),因此是α-半乳糖苷酶的主要來(lái)源.該酶在食品、飼料、醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用,受到業(yè)內(nèi)的高度重視,被認(rèn)為是最有應(yīng)用潛力的酶

2、制劑之一。
　　 本實(shí)驗(yàn)從236個(gè)土樣中篩選到一株α-半乳糖苷酶高產(chǎn)菌株,經(jīng)16s rDNA鑒定及生理生化鑒定為巨大芽孢桿菌,命名為巨大芽孢桿菌MEPE0049。以棉籽糖為底物測(cè)定比酶活為1.22 U/mg。對(duì)該菌株的產(chǎn)酶條件,包括裝液量,接種量,碳源,氮源,最適溫度,最適pH和金屬離子對(duì)其產(chǎn)酶的影響進(jìn)行了研究,以找到最適產(chǎn)酶條件,更好的使其產(chǎn)酶。
　　 此外,我們還研究了巨大芽孢桿菌MEPE0049粗酶液的最適反應(yīng)溫度

3、、溫度穩(wěn)定性,最適反應(yīng)pH值、pH值穩(wěn)定性及金屬離子Cu2+,Fe3+,Ca2+,Ni+,Zn2+,Mg2+,Mn2+,Co2+對(duì)其酶液反應(yīng)的影響.結(jié)果表明來(lái)源于該菌株的α-半乳糖苷酶粗酶液在45℃高溫時(shí)喪失其活性,且在pH小于5的條件下酶活穩(wěn)定性較差。大多數(shù)金屬離子對(duì)其活性沒(méi)有很大影響,只有Co+使酶活性降到30％以下。
　　 將Cazy數(shù)據(jù)庫(kù)中已登錄的α-半乳糖苷酶的序列與巨大芽孢桿菌的總基因組進(jìn)行比對(duì),得到兩個(gè)序列。設(shè)計(jì)四

4、條特異性引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增得到大小為1323 bp的agaA基因和大小為2226 bp的agaB基因。將該兩段基因連接到pET-29a上,在E.coil BL21中進(jìn)行表達(dá)。重組子pET-29a-agaA粗酶液沒(méi)測(cè)到酶活,而重組子pET-29a-agaB粗酶液比酶活達(dá)到9.86U/mg,將重組子pET-29a-agaB粗酶液進(jìn)行Ni-NAT柱純化,純化后比酶活達(dá)到380.66U/mg。將該酶純化后,研究其酶學(xué)性質(zhì),發(fā)現(xiàn)和粗酶的酶學(xué)性質(zhì)