百合雙色花形成的轉(zhuǎn)錄組分析及基因LhUFGT和LhSGR的功能研究.pdf

1、雙色百合花具有奇特的花被片，具有極高的觀賞價(jià)值。在百合‘Tiny Padhye’雙色花被片發(fā)育的過程中，花被片下部逐漸由綠色變?yōu)樽仙喜坑删G色變?yōu)榘咨?。然而，百合雙色花形成的分子機(jī)理尚未揭示。百合雙色花形成的分子機(jī)理的揭示可以為百合花色的人工調(diào)控及百合花色分子改良提供理論依據(jù)。
　　本研究在測定雙色百合花被片發(fā)育過程中葉綠素、花青素苷含量變化的基礎(chǔ)上，通過RNA-seq技術(shù)測定雙色花百合‘Tiny Padhye’上下部不同發(fā)育

2、時期的花被片的轉(zhuǎn)錄組，通過生物信息學(xué)手段鑒定與葉綠素代謝以及花青素苷合成通路相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子，并對參與百合雙色花形成的關(guān)鍵基因Lh UFGT和LhSGR進(jìn)行了鑒定和功能研究，從而揭示百合雙色花形成的分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如下:
　　1.雙色花百合‘Tiny Padhye’花被片發(fā)育過程中花青素苷和葉綠素含量變化
　　HPLC結(jié)果表明，在百合紫色花被片下部，僅有矢車菊素3-O-β-蕓香糖苷這一種花青素苷成分。在花被片上

3、部未檢測到花青素苷的存在。在花被片下部，花青素苷從花被片發(fā)育第一時期(S1)到第三時期(S3)逐漸升高，在第四時期(S4)則開始下降。葉綠素主要積累在花被片早期(S1和S2時期)的上下部，而在發(fā)育后期（S3和S4時期）的花被片中含量逐漸降低。
　　2.百合雙色花發(fā)育形成過程的轉(zhuǎn)錄組分析
　　為了系統(tǒng)地研究不同發(fā)育時期百合雙色花花被片的時空轉(zhuǎn)錄組變化情況，我們對雙色花百合‘Tiny Padhye’的S2時期花被片的上下部以及對

4、S1、S3和S4三個時期下部分別進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。共獲得713，120，548條高質(zhì)量序列，從頭組裝共獲得295，787條unigenes。KEGG分析表明，61個unigenes屬于了花青素苷合成基因;106個unigenes屬于葉綠素代謝通路結(jié)構(gòu)基因。進(jìn)一步的差異基因表達(dá)分析表明，花青素苷合成基因在花被片下部特異協(xié)同表達(dá)導(dǎo)致花青素苷特異地積累于花被片下部，而在花被片上部不表達(dá)。百合花被片中葉綠素含量逐漸下降的原因?yàn)殡S著花被片的發(fā)育，

5、葉綠素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因在花被片上下部的表達(dá)量逐漸下降，而葉綠素降解相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量迅速上升。此外，通過WGCNA分析，參與調(diào)控百合花被片中花青素苷合成通路以及葉綠素代謝通路的候選轉(zhuǎn)錄因子也得以鑒定。
　　3.百合雙色花花被片發(fā)育過程中qRT-PCR內(nèi)參基因的篩選
　　qRT-PCR是一項(xiàng)廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)水平研究的技術(shù)，該技術(shù)的準(zhǔn)確性依賴于穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。本研究中，10個植物中常用作內(nèi)參基因的持家基因被選為候選內(nèi)參基

6、因。分別使用geNorm、NormFinder、BestKeeper、RefFinder和比較△Ct法評價(jià)了這些候選內(nèi)參基因在百合‘TinyPadhye’不同發(fā)育時期花被片中以及不同試驗(yàn)條件下的穩(wěn)定性。最終結(jié)果表明:在花被片不同發(fā)育時期中，TIP41和ACT為最適內(nèi)參組合;在花被片遮光處理中，TIP41和F-box為最佳內(nèi)參組合;在不同組織中，ACT、ACT11和EF1-α（為最佳內(nèi)參組合;在所有樣品中，ACT、TIP41、ACT11為

7、最佳內(nèi)參組合。使用穩(wěn)定性不同的內(nèi)參分別計(jì)算了兩個花青素苷合成相關(guān)基因LhF3'H和LhUFGT的表達(dá)水平，該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了篩選到的最適內(nèi)參基因的可靠性。
　　4.花青素糖基化基因LhUFGT的克隆及功能研究
　　克隆得到花青素糖基化關(guān)鍵基因LhUFGT基因，其開放閱讀框(ORF)為1371 bp，編碼456個氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，該基因編碼的氨基酸序列與已報(bào)道的3GTs蛋白聚在一起?；驎r空表達(dá)分析表明，該基因在S1時

8、期花被片下部不表達(dá)，而在S2和S3下部表達(dá)量最高，之后隨著花被片的發(fā)育表達(dá)量逐漸下降;該基因在各個發(fā)育時期的花被片上部表達(dá)量均很低。該基因的表達(dá)趨勢和花被片中花青素苷含量的變化趨勢較相似。通過同源重組的方法成功構(gòu)建含該基因ORF區(qū)的過表達(dá)載體pCAMBIA3301-LhUFGT。該基因可以恢復(fù)3GT基因功能缺失的擬南芥突變體（ugt78d2）的表型。以上結(jié)果均表明LhUFGT蛋白具有3GTs家族成員的酶催功能。
　　5.葉綠素降解

9、基因LhSGR的克隆及功能研究
　　克隆得到葉綠素降解關(guān)鍵基因LhSGR基因，其開放閱讀框(ORF)為753 bp，編碼250個氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，該基因編碼的蛋白與已報(bào)道的單子葉植物SGRs蛋白聚在一起?；驎r空表達(dá)分析表明，該基因的表達(dá)趨勢和花被片中葉綠素含量的變化成負(fù)相關(guān)，在花被片早期（S1和S2）表達(dá)量較低而在發(fā)育后期（S3和S4）含量較高。在煙草葉片中瞬時過表達(dá)該基因可以導(dǎo)致煙草葉片黃化。證明該基因參與百合花被片中