百合COP1和SPA對(duì)光的響應(yīng)及在花香形成中的作用.pdf

1、‘西伯利亞’百合（Lilium‘Siberia’）屬于東方百合雜種系百合，具有潔白的花色、優(yōu)美的花型和濃郁的花香，其花朵揮發(fā)性香氣物質(zhì)主要為沉香醇、羅勒烯、苯甲酸乙酯等化合物,在世界切花市場(chǎng)歷來(lái)占據(jù)重要的地位。本研究以‘西伯利亞’百合為材料，利用不同光暗條件處理，通過(guò) RT-PCR、亞細(xì)胞定位、酵母雙雜交（Yeast-two hybrid）、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）、瞬時(shí)過(guò)表達(dá)、BSMV病毒沉默、熒光定量PCR和GC-MS等方法，研究

2、了百合組成型光形態(tài)建成蛋白(constitutively photomorphogenic1，COP1)在花香物質(zhì)形成中的作用以及 LoCOP1和相關(guān)互作蛋白 LoSPA、LoMYBs對(duì)光的響應(yīng)，為探究‘西伯利亞’百合香氣釋放受光調(diào)控的分子機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1．利用GC-MS技術(shù)測(cè)定光暗處理對(duì)‘西伯利亞’百合花香成分以及含量變化的影響。結(jié)果表明，黑暗和紅光處理能明顯減少‘西伯利亞’百合花朵四種主要花香成分苯

3、甲酸乙酯、沉香醇、羅勒烯和別羅勒烯的釋放；48 h連續(xù)光照和黑暗處理下，三種萜類花香成分的釋放在白光、黑暗處理下保持一致的晝夜節(jié)律性，而苯甲酸乙酯的釋放在全光照下節(jié)律明顯，黑暗無(wú)節(jié)律且釋放量顯著降低；并且‘西伯利亞’百合能對(duì)光的變化迅速做出反應(yīng)，光暗轉(zhuǎn)換4h皆有香氣物質(zhì)的顯著變化。
　　2．根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆得到了LoCOP1、LoSPA的cDNA全長(zhǎng)序列。LoCOP1的cDNA長(zhǎng)度為2067 bp，編碼689個(gè)氨基酸；LoSP

4、A的cDNA長(zhǎng)度為2676 bp，編碼892個(gè)氨基酸。RT-qPCR分析表明LoCOP1和LoSPA兩個(gè)基因的表達(dá)都在花瓣化萼片表達(dá)量最高，根中表達(dá)最低；隨著花朵的開(kāi)放，兩個(gè)基因規(guī)律基本一致，都在花瓣的初開(kāi)期最高，萼片的初開(kāi)期最低。
　　3．經(jīng)細(xì)胞核染料 DAPI染色后鑒定 LoCOP1和 LoSPA均定位于細(xì)胞核。并且LoCOP1于洋蔥內(nèi)表皮中的亞細(xì)胞定位受到光照條件的調(diào)節(jié)，黑暗下LoCOP1富集于細(xì)胞核內(nèi)，光照下細(xì)胞核內(nèi)綠色熒

5、光信號(hào)變?nèi)踝兩?，說(shuō)明核內(nèi)LoCOP1蛋白向細(xì)胞質(zhì)擴(kuò)散外移。
　　4．酵母雙雜交結(jié)果表明LoCOP1能夠與LoSPA及 LoMYB1、LoMYB3互作，LoSPA能夠與LoMYB1、LoMYB2和LoMYB3互作。通過(guò)β-半乳糖苷酶活力的測(cè)定，進(jìn)一步驗(yàn)證了其相互間的互作。雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)近一步驗(yàn)證 LoCOP1能分別與LoMYB1、LoMYB3互作，LoSPA能分別與LoMYB1、LoMYB2、LoMYB3互作。并且光能影響其互作

6、。
　　5．侵染‘西伯利亞’百合花瓣進(jìn)行瞬時(shí)干涉。結(jié)果表明，沉默LoCOP1后，LoCOP1表達(dá)量降低了42.2％，MYB1降低了72.8%，MYB2降低了80.8%,MYB3升高了30.8%，TPS降低了72.3%，AAT降低了66.7%，SPA升高了6.4%；丁酸乙酯增加1.1倍，惕各酸乙酯增加0.7倍，己酸乙酯增加2.1倍，羅勒烯增加2.9倍，沉香醇增加0.9倍，別羅勒烯增加2.9倍，苯甲酸乙酯增加0.4倍，苯甲酸甲酯增加0

7、.2倍。病毒沉默LoSPA后，LoSPA表達(dá)量降低了43.9%，MYB1降低了85.5%，MYB2降低了65.2%,MYB3升高了6.8%，TPS降低了74.4%，AAT降低了88.5%，COP1升高了53.1%；丁酸乙酯增加3.6倍，惕各酸乙酯增加1.1倍，己酸乙酯增加0.3倍，羅勒烯增加5.9倍，沉香醇增加3.5倍，別羅勒烯增加9.2倍，苯甲酸乙酯增加4.0倍，苯甲酸甲酯增加2.0倍。
　　6．侵染‘西伯利亞’百合花萼進(jìn)行瞬時(shí)

8、表達(dá)。結(jié)果表明，LoCOP1表達(dá)量升高了37.6%，MYB1降低了88.5%，MYB2降低了94.6%,MYB3降低了41.4%，TPS降低了93.2%，AAT降低了99.4%，SPA降低了1.03%；通過(guò)GC-MS對(duì)花斑測(cè)氣分析，過(guò)表達(dá)LoCOP1后，丁酸乙酯減少了77.9%，惕各酸乙酯減少51.4%，己酸乙酯減少68.8%，羅勒烯減少60.4%，沉香醇減少58.8%，別羅勒烯減少56.9%，苯甲酸乙酯減少76.4%，苯甲酸甲酯減少8