高粱原花青素四聚體與變形鏈球菌血清型c致齲毒力因子作用的光譜學(xué)研究.pdf

1、齲齒是一種發(fā)生率很高的口腔疾病，由于目前常用的干預(yù)齲齒的方法、制劑等都存在一定的缺陷，促使人們希望從天然產(chǎn)物中尋求新的高效、無(wú)毒副作用的干預(yù)齲齒的活性成分。據(jù)研究報(bào)道，植物多酚類化合物能夠有效保護(hù)口腔健康，而原花青素是以兒茶素或表兒茶素為結(jié)構(gòu)單元縮合而成的多酚類聚合物，其對(duì)齲齒的干預(yù)效果比如今公認(rèn)的抗齲制劑茶多酚更好，但是關(guān)于原花青素干預(yù)致齲菌在牙齒表面粘附的途徑和作用機(jī)制尚未研究清楚。變形鏈球菌（Streptococcus mutan

2、s，S.mutans）作為口腔中最主要的致齲齒菌之一，其在牙面上的粘附和定植是齲齒發(fā)生的關(guān)鍵，而粘附的實(shí)質(zhì)則是致齲齒菌表面粘結(jié)素與牙齒表面唾液獲得性膜上的受體蛋白相互作用的結(jié)果。葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTFs)和葡聚糖結(jié)合蛋白(GBPs)是S.mutans產(chǎn)生的重要致齲毒力蛋白，且兩者是S.mutans表面粘結(jié)素中的主要成分。GTFs在S.mutans（Ingbrittc）中主要分為三種，分別是GTFB，GTFD和GTFC，其中GTFB能夠催化

3、蔗糖產(chǎn)生水不溶性葡聚糖，這一過程對(duì)S.mutans在牙面粘附形成菌斑至關(guān)重要，gtfB的基因全長(zhǎng)約為4.8 kb，其中位于N端的催化活性區(qū)(CAT)是gtfB三個(gè)功能區(qū)段中最重要的區(qū)段。S.mutans(Ingbritt c)有4種GBPs，分別是GBPA、GBPB、GBPC和GBPD。GBPB是S.mutans在牙齒表面粘附與聚積的“橋梁”，其除了具有結(jié)合葡聚糖的功能之外，還可能與S.mutans細(xì)胞壁的形成以及其肽聚糖水解酶的活性相

4、關(guān)。本文將從高粱外種皮中分離得到的原花青素四聚體作為研究干預(yù)齲齒的天然活性成分，通過基因克隆表達(dá)技術(shù)分別得到高純度、高活性的GTFB/CAT蛋白和GBPB-sumo蛋白，并采用熒光猝滅、紫外-可見吸收光譜和圓二色譜三種常見的光譜學(xué)技術(shù)研究GTFB/CAT和GBPB-sumo兩種蛋白分別與SPC四聚體相互作用前后的結(jié)構(gòu)及活性變化，期望揭示SPC四聚體分別與GTFs和GBPs相互作用并干預(yù)S.mutans在牙齒表面粘附的作用機(jī)制。本研究主要

5、內(nèi)容包括：
　?、鸥吡煌夥N皮中原花青素四聚體的分離及鑒定。采用RP-HPLC-ESI-MS/MS對(duì)SPC-Ⅵ級(jí)分進(jìn)行鑒定，分析結(jié)果表明SPC-Ⅵ級(jí)分主要由原花青素四聚體組成。
　?、破咸烟腔D(zhuǎn)移酶B催化活性區(qū)的基因克隆及表達(dá)。根據(jù)NCBI上公布的Streptococcus mutans UA159(Ingbrittc)gtfB的cDNA序列，按照其兩端序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR克隆技術(shù)釣取S.mutans UA159的gtfB

6、/CAT基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定后連接表達(dá)載體pET-28b(+)，將重組體pET-28b(+)-GTFB/CAT轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，比較發(fā)現(xiàn)當(dāng)誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的濃度為1mmol/L時(shí)，在37℃或30℃下誘導(dǎo)4h表達(dá)效果更好。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni2+-NAT樹脂親和層析純化得到不可溶的GTFB/CAT包涵體蛋白，并經(jīng)變性-復(fù)性恢復(fù)其可溶性，最終產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE鑒定其純度約為80％，So

7、mogyi法測(cè)得GTFB/CAT蛋白的酶活和比酶活分別為131.67 mIU和1.66 IU/mg。將通過基因克隆表達(dá)得到的蛋白經(jīng)Nano LC-MS/MS鑒定，其中包含3種可信蛋白，均來(lái)自Streptococcus mutans serotype C(Strain ATCC700610/ua159)，得分最高的來(lái)源于gtfB的蛋白為目標(biāo)蛋白。
　?、瞧咸烟墙Y(jié)合蛋白B的基因克隆與表達(dá)。根據(jù)NCBI上公布的S.mutans UA15

8、9(Ingbrittc)gbpB的cDNA序列，按照大腸桿菌的偏好優(yōu)化密碼子并在體外進(jìn)行g(shù)bpB全基因的合成。將經(jīng)測(cè)序鑒定的PCR克隆產(chǎn)物連入pET-28a-sumo表達(dá)載體，將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-sumo-gbpB轉(zhuǎn)化至表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞Rosetta(DE3)中，在IPTG的濃度為0.5 mmol/L，37℃，158 r/min條件下誘導(dǎo)3h。將表達(dá)得到的蛋白上清液和蛋白沉淀分別經(jīng)SDA-PAGE檢測(cè)，在表達(dá)上清液中發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白

9、，將裂解的蛋白上清液用Ni2+-NTA親和層析純化后經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，得到蛋白純度約為90％。將基因克隆得到的GBPB-sumo蛋白經(jīng)Nano LC-MS/MS鑒定，其中3種可信蛋白均來(lái)源于Streptococcus mutans serotype C(Strain ATCC700610/ua159)，得分最高的來(lái)源于gbpB的蛋白為目標(biāo)蛋白。
　　⑷三種光譜學(xué)方法研究SPC四聚體分別與GTFB/CAT和GBPB-sumo蛋

10、白相互作用的機(jī)理。Somogyi法測(cè)得GTFB/CAT蛋白與SPC四聚體相互作用前后的酶活值分別為131.67mIU和7.59 mIU，酶活降低了94.24％，表明SPC四聚體和GTFB/CAT蛋白相互作用后抑制了其酶活。通過熒光猝滅分析得到，SPC四聚體對(duì)GTFB/CAT蛋白、GBPB-sumo蛋白的Stern-Volmer猝滅常數(shù)KSV分別為2408.1 M-1和2346.6 M-1，猝滅速率常數(shù)kq分別為2.4081×1011M-

11、1·s-1和2.3466×1011 M-1·s-1，同時(shí)SPC四聚體與兩種蛋白之間的結(jié)合常數(shù)KA分別為1522.6M-1和2618M-1，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n均為1，根據(jù)熒光猝滅發(fā)生機(jī)理推斷SPC四聚體與GTFB/CAT蛋白、GBPB-sumo蛋白之間形成了不發(fā)熒光的復(fù)合物，猝滅方式是單一的靜態(tài)猝滅。GTFB/CAT蛋白和GBPB-sumo蛋白的紫外圖譜隨著SPC四聚體濃度的增大也發(fā)生改變，其吸光強(qiáng)度均隨著SPC四聚體濃度的增大而發(fā)生明顯地變化

12、，且最大吸收峰的位置發(fā)生了不同程度的紅移，說(shuō)明SPC四聚體對(duì)蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸殘基所處的微環(huán)境造成了影響。紫外-可見吸收光譜的結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了SPC四聚體對(duì)GTFB/CAT蛋白、GBPB-sumo蛋白均是單一的靜態(tài)猝滅過程。經(jīng)圓二色光譜分析發(fā)現(xiàn)GTFB/CAT蛋白和GBPB-sumo蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)均因與SPC四聚體的結(jié)合而發(fā)生改變，其中GTFB/CAT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中不含β-轉(zhuǎn)角，隨著SPC四聚體的濃度不斷增大，α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)

13、構(gòu)的百分比逐漸下降至0.00％，β-折疊的百分比則均增加至100.00％。GBPB-sumo蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)除了與GTFB/CAT蛋白有相似的結(jié)構(gòu)變化外，其二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-轉(zhuǎn)角的百分比也減小至0.00％。由此推斷SPC四聚體與兩種蛋白之間均發(fā)生了結(jié)合，使蛋白內(nèi)維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的氫鍵遭到破壞，且其內(nèi)部疏水區(qū)域的一些氨基酸殘基可能被暴露出來(lái)，從而導(dǎo)致蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。SPC四聚體使兩種致齲蛋白結(jié)構(gòu)或活性發(fā)生改變，從而影響了S.mutans