肺炎鏈球菌血清分型方法與毒力基因轉(zhuǎn)錄水平差異的研究.pdf

1、目的:
　　本課題通過采用不同方法對肺炎鏈球菌進(jìn)行血清分型，旨在找到較快速、準(zhǔn)確、方便及經(jīng)濟(jì)的分型方法，同時對本地區(qū)肺炎鏈球菌血清型的分布有個初步的了解。通過對肺炎鏈球菌5個毒力基因(psaA、ply、lytA、cbpA、nanA)的攜帶及其mRNA轉(zhuǎn)錄水平情況的檢測，分析侵襲性與非侵襲性、不同血清型別和不同標(biāo)本來源的肺炎鏈球菌的毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平差異，探討其在侵襲性感染過程中的作用。
　　方法:
　　1.收集溫州醫(yī)科

2、大學(xué)附屬第二醫(yī)院2009年1月至2013年5月的痰液、膿液、血液、腦脊液、胸水等臨床標(biāo)本，通過典型的菌落特征，Optochin敏感試驗(yàn)，VITEK2 COMPACT型全自動細(xì)菌分析儀對收集到的標(biāo)本進(jìn)行鑒定和驗(yàn)證。
　　2.分別采用莢膜腫脹試驗(yàn)和連續(xù)多重PCR技術(shù)對鑒定后的肺炎鏈球菌進(jìn)行血清分型，并比較兩種方法的一致性。
　　3.采用普通PCR方法對肺炎鏈球菌基因組DNA的5個毒力基因(psaA、ply、lytA、cbpA、n

3、anA)進(jìn)行擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。
　　4.采用實(shí)時熒光定量PCR方法對肺炎鏈球菌5個毒力基因(psaA、ply、lytA、cbpA、nanA)的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，以16S rRNA作為內(nèi)參基因，計(jì)算采用2-ΔΔCT方法分析各毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平差異。實(shí)驗(yàn)分為侵襲性組與非侵襲性組。統(tǒng)計(jì)軟件采用Spss17.0，侵襲性組與非侵襲性組肺炎鏈球菌毒力基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平差異比較采用成組t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果P＜0.05為差異有統(tǒng)

4、計(jì)學(xué)意義;相同血清型不同組別間、相同基因不同血清型之間及不同標(biāo)本來源之間各毒力基因轉(zhuǎn)錄水平差異的比較均采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.收集到的112株菌均為肺炎鏈球菌，其中，侵襲性肺炎鏈球菌共52株，血液32株，腦脊液10株，膿液6株，胸水3株，尿液1株;非侵襲性肺炎鏈球菌共60株，均來自于痰液標(biāo)本。
　　2.莢膜腫脹試驗(yàn)，共檢出24個血清型/群，常見血清型有:19F、19A、

5、14、23F、6A、6B，其中有2株未分型;多重PCR方法，共檢出20個血清型/群，常見血清型有:6A/B、19F、19A、14、23F，其中有2株cpsA陰性，4株未分型;兩種血清分型方法的一致性一般，常見血清型分型中，兩者的一致性較高。
　　3.肺炎鏈球菌基因組DNA中5個毒力基因的攜帶情況:psaA98.2％(110/112); ply99.1％(111/112);lytA100％(112/112); cbpA98.2％(1

6、10/112); nanA99.1％(111/112)。
　　4.肺炎鏈球菌5個毒力基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平:經(jīng)計(jì)算統(tǒng)計(jì)nanA、lytA、psaA和ply，P＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，4個毒力基因在侵襲性組與非侵襲性組肺炎鏈球菌中的轉(zhuǎn)錄水平均存在差異;cbpA，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在侵襲性組與非侵襲性組肺炎鏈球菌中的轉(zhuǎn)錄水平不存在差異;分析19F、19A、14、6A/B、23F和3型各血清型之間毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平差

7、異，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)lytA在各血清型中的轉(zhuǎn)錄水平P＞0.05差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;3型中nanA、psaA、cbpA和ply的轉(zhuǎn)錄水平與其他血清型比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);在19F、19A、14、6A/B、23F和3型6種血清型/群中侵襲性組與非侵襲性組各毒力基因轉(zhuǎn)錄水平的比較中，19F和6A/B血清型中侵襲性組與非侵襲性組比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;不同標(biāo)本來源血液和腦脊液中肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)錄水平，nanA、lytA

8、、psaA和ply，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腦脊液來源的轉(zhuǎn)錄水平量高于血液來源的。
　　結(jié)論:
　　1.本院肺炎鏈球菌血清型以19F、19A、14、23F、6A和6B型為主，其中19F型最多。
　　2.在常見的血清分型中多重PCR技術(shù)可以替代傳統(tǒng)的莢膜腫脹試驗(yàn)進(jìn)行常規(guī)分型檢測。
　　3.肺炎鏈球菌基因組DNA中saA、ply、lytA，cbpA、nanA5個毒力基因普遍存在。
　　4.NanA、ly

9、tA、psaA和ply在侵襲性組肺炎鏈球菌中的轉(zhuǎn)錄水平量明顯高于非侵襲性組，而cbpA的轉(zhuǎn)錄水平不存在差異且轉(zhuǎn)錄水平下調(diào);psaA、ply、nanA和cbpA在3型中的轉(zhuǎn)錄水平高于其他血清型，3型的侵襲力高于其他血清型。
　　5.血液與痰液標(biāo)本來源的肺炎鏈球菌毒力基因轉(zhuǎn)錄水平有一定差異但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腦脊液來源與血液，痰液比較，轉(zhuǎn)錄水平量明顯增高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，腦脊液來源肺炎鏈球菌cbpA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，而nanA、lytA、ps