20個測序常見的問題

1、20 20個測序常見的問題I. 為什么需要新鮮的菌液？首先，新鮮的菌液易于培養(yǎng)，可以獲得更多的DNA，同時最大限度地 保證菌種的純度。2.如何提供菌液？如果您提供新鮮菌液，用封口膜封口以免泄漏；也可以將培養(yǎng)好的 4 5ml菌液沉淀下來，倒去上清以方便郵寄。同時郵寄時最好用盒子以免郵寄過程中壓破。3. 如何制作穿刺菌？用滅菌過1.5ml或2ml離心管加入LB瓊脂(7g/L)斜面凝固，用接種針挑取分散良好的單菌 落穿過瓊 脂直達管底，不完全

2、蓋緊管蓋適當溫度培養(yǎng)過夜，然后蓋緊蓋子加封口膜，室溫或4度保存。4. PCR PCR產(chǎn)物直接測序有什么要求？(1 )擴增產(chǎn)物必須特異性擴增，條帶單一。如果擴增產(chǎn)物中存在非特異性擴增產(chǎn)物，一般難以得到 好的測序結(jié)果；(2 )必須進行膠回收純化；(3) DNA純度在1.6—2.0之間，濃度50ng/ul以上。5. 為什么PCR PCR產(chǎn)物直接測序必須進行Agarose Agarose膠純化？如果不進行膠純化而直接用試劑盒回收，經(jīng)常會導致測序

3、出現(xiàn)雙峰甚至亂峰，這主要是非特異性擴增產(chǎn)物或者原來的PCR引物去除不干 凈所導致。大多所謂的 PCR “純化試劑盒”實際上只是回收產(chǎn)物而不能起到純化的作用的。對于非特異性擴增產(chǎn)物肯定無法去除，而且 通常他 們不能夠完全去除所有的PCR引物，這會造成殘留的引物在測序反應過程中參與反應而導致亂峰。6. 如何進行PCR PCR產(chǎn)物純化？PCR產(chǎn)物首先必須用Agarose膠電泳，將特異擴增的條帶切割下，然后純化。使用凝膠回收試劑盒 回收，產(chǎn)物用

4、ddH2O溶解。7. PCR產(chǎn)物直接測序的好處？(1) PCR產(chǎn)物直接測序可以反映模板的真實情況；(2) 省去克隆的實驗費用和時間；(3) PCR產(chǎn)物測序正確的片段進行下一步克隆實驗使結(jié)果更有保障；(4) 混合模板進行PCR的產(chǎn)物直接測序可以發(fā)現(xiàn)其中的點突變。8. 對用于測序的質(zhì)粒DNA的要求有哪些？對測序模板DNA的一般要求：(1)DNA純度要求高，1.6—2.0之間，不能有混合模板，也不能含 有RNA，染色體DNA，蛋白質(zhì)等；(2)

5、溶于ddH2O中，溶液不能含雜質(zhì)，如鹽類，或EDTA等 螯合劑，將干擾測序反應正常進行。9. 如何鑒定質(zhì)粒DNA濃度和純度？我們使用水平瓊脂糖凝膠電泳，并在膠中加入0.5ug/ml的EB(電泳緩沖液中不必加E,加一個已知 濃度的標準樣品。電泳結(jié)束以后在紫外燈下比較亮度，判斷濃度和純度。此方法可以更直接、準確 地判斷樣品中是否含有染色體DNA、RNA等，也可以鑒別抽提的質(zhì)粒DNA的不同構型。質(zhì)粒DNA的3種構型是指在抽提質(zhì)粒DNA過程中，

6、由于各種原因的影響，使得超螺旋的共價 閉合環(huán)狀結(jié)構的質(zhì)粒(SC)的一條鏈斷裂，變成開環(huán)狀(0C)分子，如果兩條鏈發(fā)生斷裂，就變成為線 狀(L)分子。這3種分子有不同的遷移率，通常，超螺旋型 (SC)遷移速度最快，其次為線狀(。分子，最慢為開環(huán)狀(0C )分子。使用紫外分光光度計檢測，或者用漠乙錠 -標準濃度DNA比較法只能檢測抽提到的產(chǎn)物中的濃度，甚至由于抽提的質(zhì)粒 DNA中含有RNA、蛋白質(zhì)、染色體DNA等因素的干擾，濃度檢測的數(shù)值也

7、是沒有多少意義的。10.為什么抽提的質(zhì)粒最好溶解在ddH2O中？出現(xiàn)這樣的情況只有兩種可能：(1)我們給您的測序結(jié)果對應的不是您的樣品；(2)您的樣品插入部分與您預期的不一致。這時需要雙方將樣品進行驗證(PCR和酶切鑒定)。18. 樣品送測序前已經(jīng)鑒定過了，有插入片段的，為什么測序結(jié)果是一個空質(zhì)粒？測序是對樣品的 最好驗證.結(jié)果為空載，可能如下：(1)可能在培養(yǎng)過程中發(fā)生插入片段的丟失，由于這種情況的發(fā)生無法事先預期到；(2)提供的 克

8、隆是假陽性克隆。19. 為什么到重復序列時(PloyA,T,C,G )后面信號幾乎都較亂？重復序列的測定是目前熒光測序 方法的一個局限。測序級的酶遇到連續(xù)的重復堿基的時候，對模板的判讀就會出現(xiàn)打滑現(xiàn)象，導致后 面的序列無法判讀。這樣的情況，建議反向測序。20. 全自動熒光測序的準確性如何？我們有兩種不同型號的測序儀：ABI377和ABI3730ABI377測序儀采用配套的Big DYE Terminator cycle sequenci

9、ng Kit,該測序方法以及安裝 儀器時 用標準樣品測試，準確性達到一個反應 500堿基中只有1個以下的錯誤(即錯誤率小于0.05%)。如果用戶得到一個測序結(jié)果的彩圖是清晰的，峰型是尖的，尖峰與讀取的堿基編碼是一 致的，那么它的準確性應該是可信的。當然如果是新序列，最好用同方向或反方向再測序一次加以 驗證。因為兩次不同的測序，同一個堿基上的錯誤概率應該小余0.0025%。同時出錯的可能性極 小。ABI3730測序儀也是采用AB公司配套的