胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF1)調(diào)節(jié)人類結(jié)直腸癌細(xì)胞耐藥株自噬變化及影響藥物敏感性的機(jī)制研究.pdf

1、背景：人結(jié)直腸癌發(fā)病率在人消化道腫瘤中占第二位，而且發(fā)病年齡有年輕化的趨勢(shì)。雖然發(fā)達(dá)國(guó)家比我們發(fā)展中國(guó)家發(fā)病率高，但是我國(guó)人結(jié)直腸癌發(fā)病率有逐年上升。有效的抗腫瘤治療，對(duì)于延緩結(jié)直腸癌患者的病情，提高生存率有重要的意義。當(dāng)前，化療藥物主要有鉑類和氟尿嘧啶類，但越來越多治療后的結(jié)直腸癌患者對(duì)鉑類和氟尿嘧啶類藥物產(chǎn)生耐藥，如何增加化療藥物的敏感性，提高化療藥物的療效是長(zhǎng)期腫瘤學(xué)科方面探討的課題。目前研究表明，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1

2、)在細(xì)胞生存、增殖、分化和代謝中起著關(guān)鍵作用，盡管對(duì)IGF-1的作用理解已經(jīng)很深入，但是關(guān)于IGF-1對(duì)腫瘤細(xì)胞自噬的影響以及機(jī)制并不是十分清楚。為此，本課題主要研究了IGF-1通過AKT/mTOR通路對(duì)人類結(jié)直腸癌細(xì)胞耐藥菌株自噬的功能影響。這將為解決人結(jié)直腸癌患者氟尿嘧啶抗腫瘤治療耐藥問題提供了新的思路，對(duì)增加藥物敏感性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的：通過體外實(shí)驗(yàn)，探討IGF-1通過AKT/mTOR通路對(duì)人類結(jié)直腸癌細(xì)胞耐藥菌株的自

3、噬影響以及可能存在的作用機(jī)制。
　　方法：通過基因芯片結(jié)果分析自噬基因與氟尿嘧啶耐藥基因的重疊，共有13個(gè)。以耐藥組中下調(diào)最多的IGF-1為研究對(duì)象。構(gòu)建DsRed-LC3的報(bào)告系統(tǒng)，以人結(jié)直腸癌細(xì)胞株 HCT-8和 HCT-8/R（人結(jié)直腸癌氟尿嘧啶耐藥細(xì)胞株）細(xì)胞為研究對(duì)象，構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。在耐藥株中，分別以IGF-1(10 nM或50 nM), MK-2206(10 nM)或3-MA(100 nM)與5-FU聯(lián)合(10 ug

4、/ml)培養(yǎng)。用流式細(xì)胞儀分析不同處理組的凋亡變化。實(shí)時(shí)定量PCR（Realtime PCR）驗(yàn)證過程中IGF-1對(duì)自噬三個(gè)階段基因表達(dá)水平的影響。用Western blotting檢測(cè)不同處理后LC3B是否發(fā)生剪切，即自噬是否增加以及IGF-1是否激活A(yù)KT。
　　結(jié)果：
　　1、耐藥細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)后，自噬小體顯著增加，而經(jīng)過IGF-1處理后自噬小體減少，但抑制了AKT后此現(xiàn)象都得到逆轉(zhuǎn)。
　　2、

5、非耐藥細(xì)胞在5-FU處理下，凋亡顯著增加，而耐藥株HCT-8/R則很少發(fā)生凋亡。不同濃度的IGF-1處理耐藥株后，在5-FU作用下，凋亡增加；如果聯(lián)合了AKT抑制劑MK-2206（10 nM），凋亡減少；但聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑3-MA（100 nM）后，凋亡則又升高。
　　3、定量PCR驗(yàn)證了IGF-1對(duì)自噬三個(gè)階段基因表達(dá)水平的影響。在起始，延長(zhǎng)和成熟階段，除 Atg16l基因的變化不明顯外，其它目的基因在 IGF-1處理后被抑制

6、，加入AKTi后，表達(dá)程度升高，而加入自噬抑制劑3-MA后，表達(dá)下調(diào)。
　　4、AKT的抑制劑MK-2206（10nM）處理后自噬增加（表現(xiàn)為L(zhǎng)C3II/I的比值升高），添加自噬抑制劑3-MA（100 nM）后比值有所降低；而在50 nM的IGF-1處理后自噬受到抑制； IGF-1誘導(dǎo)后p-AKT的表達(dá)水平增加，而加入AKTi后p-AKT的表達(dá)水平減少。
　　結(jié)論：通過耐藥組的芯片篩選出與自噬相關(guān)的基因 IGF-1，IGF-