大豆7S球蛋白亞基的分離純化.pdf

1、7S球蛋白(30％)和11S球蛋白(40％)是大豆蛋白的主要組分。11S球蛋白的熱凝膠能力強于7S球蛋白，欒廣忠等(2005)發(fā)現(xiàn)7S球蛋白亞基結(jié)構(gòu)中的糖基會影響其凝膠的形成。將7S球蛋白的亞基基因轉(zhuǎn)入到大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，可以得到重組的7S亞基，重組亞基與天然7S球蛋白亞基相比，缺少糖基結(jié)構(gòu)。本研究為探討糖基對于大豆7S球蛋白的影響，進(jìn)行了前期材料的準(zhǔn)備，包括7S大豆球蛋白的分離純化、純化后的7S球蛋白亞基分離以及重組的7S球蛋白α'

2、-亞基的分離純化，并且對各個的純化條件進(jìn)行了篩選。
　　以魯96150大豆種子為原料，利用等電點沉淀法分離出7S球蛋白。提取得到7S球蛋白后采用瓊脂糖凝膠CL-6B進(jìn)一步純化，通過調(diào)整上樣量、上樣速度、上樣濃度來篩選純化條件。7S球蛋白的最佳純化條件為:當(dāng)上樣量大于200mg，上樣濃度為100mg/ml，上樣速度為0.1 ml/min時，樣品的純化效果最好，為84.2％。此外，硫酸銨沉淀法也是常用的蛋白質(zhì)分離的方法，本研究發(fā)現(xiàn)將等

3、電點沉淀法與硫酸銨沉淀法組合以后提取出來的7S大豆球蛋白純度(81.8％)與采用凝膠層析過濾的7S球蛋白純度(84.2％)相當(dāng)。
　　7S球蛋白是由α'、α和β三種亞基通過疏水相互作用構(gòu)成的三聚體，三個亞基一定程度上具有同源性，分離三種亞基時先用強變性劑脲對7S球蛋白進(jìn)行變性處理，得到游離的三個亞基，隨后采用DEAE Fast Flow瓊脂糖凝膠FF柱來對三個亞基進(jìn)行分離。上樣速度為0.1 ml/min，上樣濃度為100mg/ml

4、，通過調(diào)整上樣量來篩選亞基的分離純化條件。結(jié)果表明:上樣濃度為100mg/ml，上樣速度為0.1ml/min時，將上樣量控制在450～500mg左右，7S球蛋白亞基分離純化過程中所得的雜蛋白峰最少，分離效果最好。
　　大腸桿菌工程菌pET-28a-α'-BL21經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后，可以得到含有重組β-伴大豆球蛋白α'-亞基(70KD)的菌液，經(jīng)細(xì)胞超聲破碎、離心得到粗提的重組α'-亞基蛋白，采用AKTA蛋白純化