hmgn2的重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其抗菌功能研究

1、四川生理科學(xué)雜志 2 0 0 5 ； 2 7 ( 4 )1 4 7T NFa n dP s e d u o m o n a sa e r u g i n o s ai n d u c et h ee x p r e s s i o no fNOD2g e n ei na i r wa ye p i t h e l i a lc e l l sZ h a n gJ u a n ， We iG u i h u a ， W a n gN i

2、a n ， F e n gY u n ， H u a n gN i n g ， W a n gB o y a o ， WuQ i( R e s e m ’ c hU n i to fI n f e c t i o na n dI m mu n i t y ， We s tC h i n aMe d i c a lC e n t e r ， S i c h u a nU n i v e r s i t y ， C h e n g d u6

3、 1 0 0 4 1 )A B S T R AC T0b j e c t i v e ： T i l ea i mo ft h i ss t u d yw a st od e s c r i b et h er e g u l a t i o no fN O D 2e x p r e s s i o ni na i r w a ye p i t h e l i a lc e l l s ．Me t h -o d s ： E x p r

4、e s s i o no fN O D 2m R N Aw a sd e t e r m i n e db yr e v e r s e - t r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n( R T - P C R) ．Re s u l t s ： T N Fa n dP s e d u -o l l l o n a sa e r u g i n

5、o s aP AO1b o t hi n d u c ea nu pr e g u l a t i o no fN OD2e x p r e s s i o ni ne p i t h e l i a le e l 1l i n eA 5 4 9 ．Co n c l u s i o n： Th et r e a t me n to fT NH l i dP s e d u o mo n a sa e r u g i n o s au p

6、 - r e g u l a t e st h ee x p r e s s i o no ft h eNOD 2g e n ei nr e s p i r a t o r ye p i t h e l i a lc e l l s ， w h i c hs u g g e s tt h a tN OD2ma ys e r v ea sa ni n n a t ei mmu n er e c e p t o rr e c o g n i

7、 z i n gr e s p i r a t o l yp a t h o g e n s ．Ke yW o r d sAi i ~a yE p i t h e l i a lC e l l s ；l n n a t ei mmu n i t y； NOD 2H M G N 2 的重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及 其抗菌功能研究 馬懿， 馮云 ， 李恒， 黃寧一 ， 吳琦 ， 王伯瑤 ( 四』 I f 大學(xué)華西醫(yī)學(xué) 中心基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院感染免疫

8、研究室， 四』 I I 成都6 1 0 0 4 1 )摘 要 目的： 構(gòu)建 H M G N 2重組表達(dá)栽體， 探討 H M G N 2分子抗茵作用。方法： 用基 因克隆的方法構(gòu)建 p E T ． 3 2 a ． c ( +) ．H M G N 2 重組表 達(dá)質(zhì)粒 ， 經(jīng) I P T G誘 導(dǎo)表 達(dá)后 ， 用親和層析 的方法 純化 H i s - H M G N 2融合蛋 白， T r i e i n e ： S D S ． P A G

9、E電泳鑒定其 分子量 ，行瓊脂糖 彌散 法檢測其抗 茵功 能。結(jié)果 ： 成功構(gòu)建 了 p E T - 3 2 a - C ( + ) - H M G I 7 重組表 達(dá)質(zhì)粒 ， 其表達(dá) 的融合蛋 白對致病性 大腸桿 茵5 4 0 8 0 ， 5 4 2 9 9以及金黃 色葡萄球 茼 A T C C 2 5 9 2 3均有抗 菌活性 結(jié)論 ： H M G N 2 是一種抗 菌分子 ， 可能參與 了體 內(nèi)的天然免 疫防御作 用關(guān)鍵詞 H M

10、 G N 2； 重組表達(dá)質(zhì)粒 ； 抗菌功能 高遷移率蛋 白( h i g bm o b i l i t yg r o u p ， H M G ) 是一種廣 泛存在 于真核生物染色質(zhì)內(nèi)的非組蛋 白， 困其分子量小， 聚丙稀酰胺 凝膠 電泳時遷移快 速而得名。近年來 研究發(fā) 現(xiàn) H M G主要結(jié)合 于 真核細(xì)胞的活性 轉(zhuǎn)錄基 因 的核 小體 區(qū)域 內(nèi)， 在維持染 色質(zhì)活 性結(jié)構(gòu) ， 以及基 因轉(zhuǎn)錄 ， 復(fù) 制等 過程 中起著 重要 作用 ?

11、 。H M G生門可分 為 H M G A、 H MG B、 H MG N三 個不 同 的家族 。H MG N 2為H MG N家族分子之 - -h I MG N 2分子除 了基 因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有 是外 ， 目前對 H MG N 2分 子其 它 的生 物 學(xué)功 能 報道 相對 較 少。奉實(shí)驗利用基 因克隆 的方法構(gòu) 建 了 p E T ． 3 2 a - e ( +) - H M G N 2 重 組表達(dá)質(zhì)粒 ， 經(jīng) I P T G誘 導(dǎo)

12、后 ， 用 親 和層 析 的方 法純 化 融合 蛋 白， 然后行瓊脂糖彌 散法 抗菌 實(shí)驗 ， 以證 實(shí)此融 合蛋 白 的抗 菌 功能。1材料 與方 法 I1材料 I ． 1 ． 1主要 試劑瓊脂糖 、 溶 菌酶 、 胰 蛋 白胨 、 酵母 提取 物 、大豆培 養(yǎng) 基 ( S i g m a公 司 ) 。丙 烯 酰 胺 、 甲叉 雙 丙 烯 酰 胺 、1 7 E M E D 、 蛋 白質(zhì) M a r k e r ( M e r c k公

13、 司 ) ； 瓊 脂 糖 、 溶菌 酶 、 過硫 酸 錢 、 T r i s 、 T r i c i n e ( S i g m a 公 司 ) ?？?馬斯亮 藍(lán) R - 2 5 0 ( 上海 試劑 廠 進(jìn) 口分裝產(chǎn) 品)引物( T a k a r a 公 司) ， 連接試劑盒 、 限制性 內(nèi)切 酶 、 T a gP C R多聚酶 ( F e r m e n t a s 公司 ) ， 質(zhì)粒 提取試劑盒 、 P C R純 化試劑盒 ( O

14、 M I G A公司 ) ， 瓊 脂糖凝膠 、 I P T G ( 華美公司) 。1 ． 1 ． 2主要菌種 致病性大腸桿菌 5 4 0 8 0 ， 5 4 2 9 9以及金黃色 葡萄球菌 A T C C 2 5 9 2 3 、 糞 腸球 菌 1 6 1 7 5 、 宿主菌 D E 3 及原核表達(dá) 質(zhì)粒 p E T - 3 2 a - C ( + ) 、 重組 質(zhì)粒 p C D N A3 ． 1 - H M G N 2 均 為本室保 存

15、 。11 ． 3主要 儀器 純 水儀 ( M i l l i p o r e 公 司 ) 、 超 凈工作 臺( 蘇 凈集團(tuán) ) P C R儀 ( B i o m e t r a 公 司 ) ， P O WE I L ／ P A C 3 0 0 0電 泳裝 置 ( B I O — R A D公 司) ， 凝膠 成相 儀 ( D B T ~ 8E E C公司 ) 。低壓 色譜 儀 、 H i s T r a pK i t ( A m e r

16、 s h a m公司 )1 ． 2方法 1 ． 2 ． 1H M G N 2目的分子 片段 的制備 根據(jù) G e n B a n kH M G N 2C D N A ( 登 錄號 ： N M 0 0 5 5 1 7 ) 序列設(shè) 計 兩對 特異 引 物 ： P 15 ， A T AG GA T C CA TGC C CAAG AGAAA3’ P 25’ C C GGA ATr CAC AC r r I 、 C A CT r GG 。

17、用 P C R方法從 重組 質(zhì)粒 p C D N A3 ． 1 一 H M G N 2擴(kuò)增出 目的分 子。 條件為 ： 9 5 ~ C3 OS ， 5 0 ％ 3 0 s ， 7 2 ~4 5 s ， 3 0 個循 環(huán) 。1 ． 2 ． 2重組 H M G N 2 分 子的連接轉(zhuǎn)化 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) P C R純化 試劑盒純化后 ， 用 E C O R 1 及 B A M H 1 雙 酶切 ， 然后 按 常規(guī) 方法 連接于經(jīng)同樣 雙酶切 的原

18、 核表 達(dá)質(zhì)粒 p E T 一 3 2 a( +) 載體 。 將 +本項 目受 C M B基金( 9 8 - 6 8 1 ) 和國家 自然科 學(xué)基金( N O ： 3 0 4 7 0 7 6 3 ) 資助。一 通訊作 者維普資訊 http://www.cqvip.com 四川生理科學(xué)雜志 2 0 0 5 ； 2 7 ( 4 )1 4 9ma ． ． E u r ． J ． B i o c h e m． 1 9 9 0． 1 9 2． 8

19、 1 - 8 64Tm j eL．J o s t e i nH．To m K． HMG1 7i nme t a p h a s e — r e' r e s t e da n di n t e T ’p h a s eH e 1 ． as 3C E 1L S ． F e b s l e t t e r s ， 1 9 8 1 ， ( 1 3 3 )1 ： 8 4 - 8 85Ul l o aI．B a t l i wa l l

20、aF M ． An d m~ s o nUe ta 1 ． Hi g hmo b i l i t yg r ou pb o xc h r omo s o ma lp r o t e i n1a 8an u c l e a rp r o t e i n．e y t o k i n e．a(chǎn) n dp o t e n t i a lt h e r a p e u —t i ct a r g e ti nm' t h r i t i s

21、 ． Ar t h r i t i sRh e um．2 0 0 3． 4 8： 8 7 6 — 8 816姚詠明 。 劉輝．對高遷移族蛋 白 B 1 作用 的新 認(rèn)識．中 吲危重病急 救醫(yī)學(xué) ． 2 0 0 5 ． 1 7 ( 7 ) 3 8 5 - 3 8 7Co n s t r u c t i o no fr e c o mb i n a n tp r o k a r y o t i ce x p r e s s i n gp l

22、 a s mi do fHM GN2a n ds t u d yo ni t sa n t i mi c r o b i a la c t i f it yMaY i ，F(xiàn) e n gY u n ， L iH e n g ， H u a n gN i n g ， WuQ i ， Wa n gB o y a o( R e s e a r c hU n i to fh f e c t i o na n dI m mu n i t y ， W

23、e s tC h i n aS c h o o lo fP r e c l i n i c a la n dF o r e n s i cMe d i c i n e ， S i c h u a nU n i v m ~ i t y ， C h e n g d u6 1 0 0 4 1 )A b s t r a c t0b j e c t i v e ： T oe x p r e s sa n dp u r i f yr e c o m

24、 b i n a n tHM G N 2p r o t e i na n di n v e s t i g a t ei t sa n t i m i c r o b i a la c t i v i t y ．Me f l t o d s ： T h er e —c o m b i n a n tp r o k a r y o t i ce x p r e s s i n gp l a s m i dp E T - 3 2 a — c

25、 (十) 一 HM G N 2w a sc o n s t r u c t e db yg e n ec l o n i n g ．I n d u c e db yI F r G ，t h ef u s e dp a o t e i nw i t ht h eh i s t i d i n e — t a g g e dwa ． sp u r i f i e db yHi s T r a pK i ta n di d e n t i f

26、 i e db yT r i c i n e - S DS - P AGE ．T h ea n t i mi c r o b i a la c t i v i t yWa Sd e t e c t e db ya g a rd i f u s i o nt e s t ．Re s u l t s：T h er e c o mb i n a n tHMGN2p r o t e i nWa Sa g a i n s tt h ep a t

27、h o g e n i cs t r a i n sE． c o l i5 4 0 8 0、 5 4 2 9 9a n dS ． a u r e u sA T CC2 5 9 2 3 ．Co n c l u s i o n：HMGN 2p r o t e i ni saa n t i mi c r o b i a lmo l e c u l ea n di ti sp r o b a b l yi n v o l v e di nt h

28、 ed e f e n s i v eo ft h ei n n a t ei mmu n i t yi nv i v o ．Ke ywo r d sHMGN 2；p r o k a r y o t i ce x p r e s s i n gp l a s mi d；a n t i mi e r o b i a la c t i v i t y雙氫青蒿素對 C p GO D N誘導(dǎo)小 鼠 R A W2 6 4 ． 7 細(xì)胞釋放細(xì)胞 因

29、子 的影 響李斌’ ， 張樂之’ ， 王俊， 鄭江． 余雙江， 羅平 ， 周紅 (第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部藥理學(xué)教研 室；第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院醫(yī)學(xué)綜合實(shí)驗研 究中心 ， 重慶)摘 要 目的： 觀察雙氫青蒿素對 C p GO D N誘導(dǎo)小鼠R A W 2 6 4 ． 7細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的影響。方法： 體外培養(yǎng)小鼠R A W 2 6 4 ． 7細(xì)胞． 用C p GO D N刺激小鼠 f L A W2 6 4 ． 7細(xì)胞分泌T N F、 I L

30、一 6 ， 用不同濃度雙氫青蒿素進(jìn)行拮抗， E L I S A法檢測培養(yǎng)上清中 促炎細(xì)胞因子的含量． ． 結(jié)果 ： 雙氫青蒿素可抑制 C p GO D N刺激 小鼠 R A W2 6 4 ． 7細(xì)胞釋放 T N F —和 I L 一 6 ， 并呈一 定的 量效 關(guān) 系， 其 中對 I L - 6最大抑制率可達(dá)到 6 6 ． 5 ％ 。 而對 T N F —釋放 的最大抑制率僅為 7 ． 2％ ， 其 影響細(xì)胞 因子釋放 的作 用與細(xì)胞毒

31、作 用無 關(guān)。結(jié)論 ： 雙氫青篙素呈濃度依 賴性 地抑制 C p GO D N刺 激小鼠 R A W 2 6 4 ． 7 細(xì)胞釋放 T N F —和 I L 一 6 ， 但對 T N F —的影響較 小。關(guān)鍵詞 雙氫青蒿 素 ； C p GO D N ； L P S ； 熱滅活 E C ； 細(xì)胞 因子 雙氫青蒿索( d j h y d r 0 a l 1 e m i s i n i n ， D H A ) 是 中草 藥青蒿 的提 取物青

32、蒿素及其衍生物在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物和有效成份。本實(shí) 驗室近期的研究發(fā)現(xiàn)， 青蒿索可明顯降低多種致炎因素誘導(dǎo)的R A W 2 6 4 ． 7細(xì)胞 T N F - 和 I L - 6 釋 放 ， 對致 死 劑量 C p GD N A ? 、L P s 和滅活大腸桿菌攻擊小 鼠的有 明顯保護(hù)作用 。另有文 獻(xiàn)報 道 ， 雙氫青篙素可 明顯降低卡 氏肺孢子 蟲肺炎大 鼠肺 泡 巨噬細(xì) 胞產(chǎn)生 T N F —水平 ， 對 B X S B狼瘡小 鼠血

33、清中 T N F ·的分泌 也 有抑制作用， 以上 均提 示 D H A可能 廿 _ ! I 有類 似于青 蒿 索的作用 。本實(shí)驗 旨在觀察 D H A對 C p GO D N誘 導(dǎo)小 鼠 R A W2 6 4 ． 7細(xì)胞釋放細(xì)胞因子的影響， 從而為青蒿素類衍生物是否對細(xì)菌 攻擊小 鼠的也具有保 護(hù)作 用 以及能否 用 于臨床 膿毒 癥的 治療 提供進(jìn)一步的理論依據(jù) 1 材料 與方 法 1 ． 1 材料 雙 氫青 蒿 索 (

34、D H A ， 購 自重 慶 涪 陵 山制 藥 有 限公 司， 以少量二 甲基亞砜 ( D M S O ) 溶解配成母 液 ， 超 聲助溶 ， 4 q C 保 存 ； 實(shí)驗前 用培 養(yǎng)基 稀釋 至所 需濃 度 ( D M S O終 濃 度小于 0 ． 5％) ； 小 鼠巨噬細(xì)胞系 R A W2 6 4 ． 7 ( 購 自 美 國 A T C C公 司 ) ； 全硫 代修飾 C p GO D N1 8 2 6 ( 上海博亞生物技術(shù)有限公司

35、合成 ， 序列 為 5 ； T C c A T G A c ( ' 1 T C cr G A c G T r 一 3； ， J 、 鼠 T N F —、 I L - 6E L I S A檢測試劑盒 ( 上海 晶美生 物工 程有 限公 司 ) ； 低 內(nèi)毒素胎牛血 清( 美國 P A A公 司) ； 鱟試劑 和 內(nèi)毒 素檢 查用 水 購于 廣東 湛江 安度斯生物有限公 司； 實(shí)驗 用移液管 、 吸管 等玻璃器 材均經(jīng) 2 5 0

36、o c高溫 3h 去熱原處 理 ； 培養(yǎng) 板 、 離 心管 購 自美 國 B D公司 ， 無熱 原 ， 一次性使用 ； 其他塑料器材均輻 照去熱原。1 ． 2 實(shí)驗 方法 1 ． 2 ． 1 細(xì)胞實(shí)驗 試劑 內(nèi)毒 素古 量 測定 取 鱟試劑 1 支 ， 加入 1 ． 2 5m l 的 內(nèi)毒素檢 查用 水稀 釋混 勻 ； 將 L P SO 1 1 l ： B 4用檢查 用水稀 釋為 2n g ／ m l ， 設(shè)定 為陽性對 照 ， 陰性對

37、 照用 內(nèi)毒索檢查 用水代替 ； 取陰性對 照、 陽性對 照 及樣 品液 各 1 0 0 1 x l ， 分別加 入 1 0 0l 鱟試劑稀釋液中 ， 將檢測試 管置于 E D S - 9 9 細(xì)菌 內(nèi)毒素測定系統(tǒng)中進(jìn)行檢測； 按下式計算 L P S 測定值： L P S測定值 = L P S實(shí)測值／ 回吸收率 ； 每一樣 品和對 照重復(fù) 4 次。1 ． 2 ． 2R A W 2 6 4 ． 7細(xì) 胞 的 培 養(yǎng) 與 傳 代 小 鼠