四川黑茶渥堆過程中纖維素酶、果膠酶分泌菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化.pdf

1、四川黑茶具有獨特的地域性和政治特征，其品質(zhì)高低直接影響邊疆少數(shù)民族同胞的身體健康、邊疆穩(wěn)定和民族團結(jié)。渥堆作為四川黑茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵工序，其濕熱環(huán)境有利于微生物的生長、繁殖，渥堆微生物所分泌的纖維素酶、果膠酶等水解酶類對四川黑茶品質(zhì)的轉(zhuǎn)化及形成功不可沒。研究者對黑茶渥堆過程的微生物進行了大量研究，但對四川黑茶渥堆微生物所分泌的纖維素酶、果膠酶及其相關(guān)性質(zhì)的研究卻未見報道。因此，明確四川黑茶渥堆微生物中分泌纖維素酶、果膠酶的主要微生物種類

2、，研究其纖維素酶特性，深入分析其在四川黑茶品質(zhì)形成中的具體作用，對于擴大食品等行業(yè)纖維素酶、果膠酶微生物來源及其進一步應(yīng)用，縮短四川黑茶生產(chǎn)周期，提高其品質(zhì)具有重要意義。此外，進一步探索和優(yōu)化微生物纖維素酶產(chǎn)酶條件，對于提高微生物纖維素酶活性具有重要的實踐意義。
　　本研究擬采用分子生物學(xué)、生物信息學(xué)手段，微生物平板技術(shù)及常用手段相結(jié)合的方式，篩選四川黑茶渥堆微生物中纖維素酶、果膠酶分泌菌株，并對其酶學(xué)特性進行研究，對纖維素酶分泌

3、菌株的產(chǎn)酶條件進行探索和優(yōu)化。此外，采用液態(tài)發(fā)酵的方式分析纖維素酶、果膠酶分泌菌株對液態(tài)茶品質(zhì)成分的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)從四川黑茶渥堆微生物中共篩得分解纖維素效果較好的菌株18株，其中，酵母菌1株，霉菌6株，放線菌7株，細菌4株，其分解纖維素能力大小依次為:放線菌＞細菌＞酵母菌＞霉菌。搖瓶發(fā)酵復(fù)篩實驗發(fā)現(xiàn)，放線菌分泌纖維素酶活性整體高于細菌和真菌，綜合初篩、復(fù)篩結(jié)果，選擇SDT18、SDT53、SDT95號菌株為分

4、泌纖維素酶的高產(chǎn)菌株。分子生物學(xué)分析結(jié)果分別將SDT18、SDT95、SDT53號菌株初步鑒定為Aspergillus niger strain FCBP648（黑曲霉）、Bacillusubtilis strain ZZ120(枯草芽孢桿菌）、Streptomyces diastaticus subsp.ardesiacusstrain HDJZ-zwm-45（淀粉酶鏈霉菌亞種）。搖瓶培養(yǎng)期間，SDT95號菌株其菌株生物量隨培養(yǎng)時間的

5、延長呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，而其CMCase和FPA酶活性并未出現(xiàn)大幅度的變化;使SDT95號菌株的CMCase酶活達到最大時的酶反應(yīng)pH為5，使其CMCase酶活較高的酶反應(yīng)溫度依次為45℃＞55℃＞40℃＞50℃。
　　(2)在液體培養(yǎng)基組分及濃度優(yōu)化的單因素實驗基礎(chǔ)上，采用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計實驗對培養(yǎng)基組分及濃度進行優(yōu)化，得出利于纖維素酶分泌菌株SDT95產(chǎn)CMCase的液體培養(yǎng)基組分配比為:葡萄糖1.68％，牛肉膏0.82％

6、，氯化鈉0.32％，磷酸氫二鉀0.22％，利于菌株產(chǎn)FPA的液體培養(yǎng)基組分配比為:葡萄糖1.63％，牛肉膏0.86％，氯化鈉0.37％，磷酸氫二鉀0.16％。在搖床培養(yǎng)條件優(yōu)化的單因素實驗基礎(chǔ)上，利用二次通用旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計實驗對搖床培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，得出利于SDT95菌株CMCase酶活提高的搖床培養(yǎng)條件為:菌株接種量2ml，發(fā)酵培養(yǎng)時間6d，搖床培養(yǎng)溫度29℃。實驗所考察的3個因素對FPA酶活的影響均較小，F(xiàn)PA酶活可能還受到其它未被考

7、慮進實驗方案的因素所影響。
　　(3)從四川黑茶渥堆微生物中初篩得到分泌果膠酶效果較明顯的菌株共19株，其中，酵母菌1株，霉菌6株，放線菌9株，細菌3株。搖瓶發(fā)酵復(fù)篩實驗測得各類群微生物分泌果膠酶活性依次為放線菌＞細菌＞霉菌＞酵母菌。結(jié)合初篩、復(fù)篩結(jié)果選得SDT22、SDT60、SDT87號菌株為分泌果膠酶的高產(chǎn)菌株。分子生物學(xué)分析結(jié)果分別將SDT22、SDT87、SDT60號菌株初步鑒定為Penicilliumcommune s

8、train G20-23（普通青霉）、Streptomyces thermoviolaceus（熱紫鏈霉菌）、Streptomyces pactum strain173612（密旋鏈霉菌）。
　　(4)篩得的分泌纖維素酶、果膠酶效果較好的菌株在以純茶湯為培養(yǎng)基的單菌液體發(fā)酵實驗中均能造成茶湯中茶多酚含量的降低;除SDT93號菌株外，均能造成茶湯中茶黃素含量的增加;供試菌株對茶湯茶紅素、茶褐素含量的影響相對比較復(fù)雜;除SDT4、87