中國對(duì)蝦(Penaeus chinensis)原肌球蛋白抗原表位和關(guān)鍵氨基酸的篩選及糖基化對(duì)其過敏原性的影響.pdf

1、中國對(duì)蝦作為中國沿海區(qū)域主要的對(duì)蝦養(yǎng)殖品種，其味道鮮美、營養(yǎng)豐富，受到廣大消費(fèi)者的喜愛。但由中國對(duì)蝦引起的過敏案列也日益增多，而現(xiàn)階段對(duì)其過敏性研究，仍處于起步階段。過敏影響人體健康，甚至危害生命，故探究對(duì)蝦過敏原致敏機(jī)制對(duì)過敏的預(yù)防和治療都有重要意義。在已鑒定中國對(duì)蝦主要過敏原為原肌球蛋白的基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步深入研究，在氨基酸分子層面結(jié)合其結(jié)構(gòu)探查其致敏機(jī)制，主要通過生物信息學(xué)方法預(yù)測原肌球蛋白的表位，多方法篩選抗原多肽，預(yù)測其關(guān)鍵氨

2、基酸并建立空間模型。在此基礎(chǔ)上，利用糖基化法消減蛋白和表位多肽的過敏原性。主要內(nèi)容如下:
　　1、利用生物信息學(xué)軟件DNAstar和AntheProt，結(jié)合三種在線預(yù)測生物學(xué)網(wǎng)站，分析中國對(duì)蝦主要過敏原（原肌球蛋白）的氨基酸序列，綜合預(yù)測出12條潛在抗原表位并用Fmoc法固相合成。通過icELISA法和dot-blot法，借助30位對(duì)蝦過敏患者的特異性血清，篩選出10條與血清呈現(xiàn)高的親和力的表位多肽。
　　2、通過生物信息學(xué)

3、分析原肌球蛋白的氨基酸序列，借助SWISS-MODEL建模工具，篩選出模板野豬原肌球蛋白1c1g。用軟件PyMOL修改模板氨基酸序列，得到中國對(duì)蝦原肌球蛋白的空間構(gòu)象模型，并用VMD軟件分析模板的拉式構(gòu)象圖，結(jié)果顯示建模模板合理。從模型構(gòu)象中可以看出，中國對(duì)蝦原肌球蛋白構(gòu)象以α-螺旋的二級(jí)結(jié)構(gòu)為主，沒有復(fù)雜的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白不具有形成構(gòu)象表位的條件，多肽為線性表位且暴露在外側(cè)。本文利用軟件BioEdit分析蛋白質(zhì)氨基酸和表位中氨基酸

4、的出現(xiàn)頻率，同時(shí)用軟件Vector NTI對(duì)比中國對(duì)蝦原肌球蛋白和SDAP數(shù)據(jù)庫中過敏食物原肌球蛋白的氨基酸序列，分析其保守性，綜合兩種方法分析得出潛在的表位關(guān)鍵氨基酸。以多肽T-03、T-07和T-12為例，將表位中潛在關(guān)鍵氨基酸突變?yōu)楸彼?，并進(jìn)行固相合成。用icELISA法借助血清分析突變后多肽的過敏原活性變化，結(jié)果顯示突變肽T-03中的D、T-07中的D、E和T-12中的E，與抗體IgE結(jié)合程度明顯下降，說明這幾個(gè)氨基酸為各自表

5、位中的關(guān)鍵氨基酸。
　　3、利用核糖、低聚半乳糖、低聚殼聚糖對(duì)原肌球蛋白和抗原表位進(jìn)行糖基化，可顯著消減其過敏原活性。而蛋白、抗原表位與麥芽糖糖基化后的產(chǎn)物則無明顯的免疫原活性變化。借助ELISA法、圓二色譜法及有效賴氨酸含量測定，對(duì)三種糖糖基化后產(chǎn)物進(jìn)行檢測分析。結(jié)果顯示，在糖基化反應(yīng)20 min-4 h時(shí)，蛋白糖基化產(chǎn)物與血清IgE的結(jié)合能力無明顯變化;8h-12 h時(shí)，糖基化產(chǎn)物與血清IgE的結(jié)合能力有所下降，說明過敏蛋白的

6、免疫原活性減弱。抗原多肽在20min-2h時(shí)，過敏原性無明顯變化;4-12h時(shí)，多肽過敏原性減弱。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，原肌球蛋白核糖糖基化產(chǎn)物α-螺旋結(jié)構(gòu)下降了13.79％，低聚半乳糖糖基化產(chǎn)物α-螺旋結(jié)構(gòu)下降了10.47％，低聚殼聚糖糖基化產(chǎn)物α-螺旋結(jié)構(gòu)下降了10.34％。多肽與低聚半乳糖、低聚殼聚糖糖基化產(chǎn)物，α-螺旋結(jié)構(gòu)也呈現(xiàn)下降趨勢，核糖作用糖基化后產(chǎn)物則無規(guī)律性變化。原肌球蛋白的賴氨酸含量有明顯的下降趨勢，多肽的有效賴氨酸含量

7、則無明顯的變化規(guī)律。
　　4、利用血清IgE介導(dǎo)人源肥大細(xì)胞脫顆粒釋放模型，分析檢測原肌球蛋白和抗原表位的過敏原性?？乖畹蜐舛? ug/mL時(shí)，肥大細(xì)胞進(jìn)行脫顆粒。組胺、類胰蛋白酶和β-己糖胺酶是檢測肥大細(xì)胞脫顆粒的主要指標(biāo)，其結(jié)果顯示有10條多肽為過敏原，同icELISA和dot-blot檢測結(jié)果一致，且以多肽T-03、T-07和T-12釋放量最多。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、細(xì)胞趨化因子（IL-1β、IL-