霍山石斛生物鐘相關(guān)基因克隆及其與培養(yǎng)物糖含量分析.pdf

1、霍山石斛（Dendrobium huoshanense Tang et Cheng）是多年生蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium Sw.）植物，在中國(guó)傳統(tǒng)中藥里被譽(yù)為仙草之首，同時(shí)也具有觀賞價(jià)值。本研究對(duì)霍山石斛原球莖和試管苗的離體培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化；對(duì)不同光周期培養(yǎng)條件下原球莖和試管苗的增殖率、器官發(fā)生和組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)以及多糖含量進(jìn)行了觀察和測(cè)定；以原球莖和試管苗為材料，克隆了生物鐘中央振蕩器核心基因(CIRCA

2、DIAN CLOCK-ASSOCIATED1， CCA1)和與中央振蕩器相關(guān)的抗逆基因MYB1R1，對(duì)CCA1基因和MYB1R1基因進(jìn)行不同光周期處理，并研究分析其定量表達(dá)結(jié)果，最終通過(guò)綜合研究離體培養(yǎng)條件下不同光周期、不同培養(yǎng)環(huán)境、增殖率、多糖含量及基因表達(dá)的關(guān)系，為揭示霍山石斛多糖代謝機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)生物學(xué)和分子生物學(xué)的理論和依據(jù)。
　　1.不同光周期條件下霍山石斛的增殖率?；羯绞蚯o培養(yǎng)于MS+NAA0.1mg/L+KT0.

3、05mg/L+土豆汁50 g/L培養(yǎng)基，試管苗培養(yǎng)于1/2MS+IBA0.5mg/L+NAA0.5 mg/L+香蕉汁200g/L培養(yǎng)基，比較了原球莖及試管苗在不同光周期處理下的增殖率。
　　試驗(yàn)結(jié)果表明，不同光周期對(duì)原球莖增殖率有一定影響：在黑暗培養(yǎng)條件下最低；在24h、18h、12h、6h光照的光周期條件下培養(yǎng)50天時(shí)增殖率達(dá)到最高并具有相近的增殖率；其中以18小時(shí)光照在培養(yǎng)50天時(shí)增殖率達(dá)到最高；同時(shí)24小時(shí)光照條件下增殖率在

4、各培養(yǎng)時(shí)間段都表現(xiàn)出最高值并在培養(yǎng)40d時(shí)已經(jīng)接近峰值。不同光周期對(duì)試管苗增殖率影響幅度較原球莖的?。蛔耘囵B(yǎng)10d后，以12h/12h L/D光照條件下增殖率領(lǐng)先，并保持最高。但總體上原球莖增殖率遠(yuǎn)高于試管苗增殖率。
　　2.不同光周期培養(yǎng)條件下多糖含量的測(cè)定?；羯绞蚯o培養(yǎng)于MS+NAA0.1mg/L+KT0.05mg/L+土豆汁50 g/L培養(yǎng)基，試管苗培養(yǎng)于1/2MS+IBA0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L培養(yǎng)基

5、，比較原球莖及試管苗在不同光周期下的多糖含量。
　　試驗(yàn)結(jié)果表明：6小時(shí)光照和全黑暗條件下多糖積累首先到達(dá)最高值，之后逐漸降低；其中以原球莖在6小時(shí)光照條件下培養(yǎng)10d多糖含量已達(dá)到峰值。24小時(shí)光照處理?xiàng)l件下的原球莖和試管苗多糖含量在培養(yǎng)30d時(shí)同樣達(dá)到高水平，之后逐漸降低；其中以試管苗在24小時(shí)光照處理下培養(yǎng)至30d達(dá)到峰值。培養(yǎng)40d及之后，各光周期條件均表現(xiàn)出多糖含量下降至接種時(shí)的多糖含量，說(shuō)明在培養(yǎng)基養(yǎng)分接近消耗殆盡時(shí)（

6、40d-50d），無(wú)法繼續(xù)進(jìn)行多糖積累，只能維持自身生長(zhǎng)發(fā)育。不同光周期對(duì)試管苗的多糖含量較對(duì)原球莖的影響較大，在培養(yǎng)10d之后，光照的增加與多糖含量呈正相關(guān)。試管苗多糖積累水平均高于同期培養(yǎng)時(shí)間的原球莖，而原球莖的多糖積累早于試管苗的多糖積累。
　　3.CCA1基因和MYB1R1基因的克隆和生物信息學(xué)分析。以霍山石斛原球莖和試管苗為材料，結(jié)合同源克隆和RACE技術(shù)，首次獲得了霍山石斛CCA1基因和MYB1R1基因的cDNA全長(zhǎng)：

7、CCA1基因cDNA全長(zhǎng)為1652 bp，登錄號(hào)為KX710175；MYB1R1基因cDNA全長(zhǎng)1332 bp，登錄號(hào)為KX710176。這2條基因的cDNA序列的開放閱讀框分別編碼532和427個(gè)氨基酸。通過(guò)對(duì)CCA1基因和MYB1R1基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CCA1是堿性蛋白， MYB1R1是酸性蛋白，都不具有信號(hào)肽，也都不屬于分泌蛋白；其中CCA1和MYB1R1中均含有myb保守結(jié)構(gòu)域，證明了CCA1與MYB1R1同屬于MYB轉(zhuǎn)

8、錄因子家族。
　　4.CCA1基因和MYB1R1基因定量表達(dá)分析。以Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，對(duì)CCA1基因和MYB1R1基因在原球莖和試管苗不同光周期處理下的表達(dá)水平進(jìn)行定量表達(dá)分析。本實(shí)驗(yàn)以接近自然晝夜周期的12小時(shí)光照為參照組，在培養(yǎng)第1d、10d、20d、30d、40d及50d時(shí)對(duì)材料進(jìn)行基因定量表達(dá)分析。結(jié)果顯示：CCA1基因、MYB1R1基因在原球莖中的表達(dá)趨勢(shì)基本相同，在試管苗中的表達(dá)趨勢(shì)也基本相同。CCA1基因在原

9、球莖中一般先于MYB1R1基因出現(xiàn)表達(dá)波動(dòng)，在試管苗中兩者則基本同步。CCA1基因、MYB1R1基因在原球莖的表達(dá)趨勢(shì)和試管苗中的表達(dá)趨勢(shì)都不相同。兩者在原球莖中的表達(dá)量高于試管苗中的表達(dá)量。根據(jù)長(zhǎng)時(shí)間尺度基因表達(dá)的數(shù)據(jù)推測(cè)：MYB1R1基因具有部分生物鐘的節(jié)律功能，或是與生物鐘中央振蕩器直接作用的基因。
　　原球莖在培養(yǎng)第30d時(shí)，每隔6h對(duì)不同光周期處理材料取樣，以12小時(shí)光照為參照組，觀察CCA1基因和MYB1R1基因在24

10、h內(nèi)的變化趨勢(shì)。結(jié)果顯示：CCA1基因在30d時(shí)已經(jīng)全部偏離12h/12h光周期，出現(xiàn)不等振幅及不同光周期的現(xiàn)象；MYB1R1基因在培養(yǎng)第30d時(shí)與CCA1基因相比更接近原來(lái)的12h/12h光周期；MYB1R1基因在本實(shí)驗(yàn)條件下也出現(xiàn)不等振幅及周期變化；MYB1R1基因與CCA1基因表達(dá)趨勢(shì)相近。根據(jù)短時(shí)間尺度基因表達(dá)的數(shù)據(jù)推測(cè)：MYB1R1基因可能具有部分生物鐘的節(jié)律功能，或是與生物鐘中央振蕩器直接作用的基因。
　　以18SrR

11、NA為參照，在半浸沒(méi)及干旱脅迫等條件下處理48小時(shí)，結(jié)果顯示MYB1R1基因在半浸沒(méi)及干旱處理?xiàng)l件下出現(xiàn)明顯表達(dá)變化，在黑暗條件下也出現(xiàn)高表達(dá)，說(shuō)明MYB1R1基因與光照和干旱脅迫有關(guān)，可能參與干旱的信號(hào)傳導(dǎo)。
　　綜上所述，以CCA1基因?yàn)閰⒄諛?biāo)志的光周期研究發(fā)現(xiàn)，光周期影響霍山石斛的多糖含量，以及增殖率和干物質(zhì)含量；原球莖更適于光周期誘導(dǎo)的多糖含量調(diào)控。CCA1基因在原球莖中的上升表達(dá)早于在試管苗中的表達(dá)。CCA1基因在出現(xiàn)高

12、上調(diào)表達(dá)后，一般會(huì)導(dǎo)致各生理指標(biāo)的提高。CCA1基因、MYB1R1基因在原球莖中表達(dá)的幅度大于在試管苗中的幅度，但CCA1基因和MYB1R1基因表達(dá)趨勢(shì)基本相似。在第30d的24h時(shí)間尺度上研究中發(fā)現(xiàn)，CCA1基因和MYB1R1基因在偏離半光照條件下出現(xiàn)時(shí)間偏離和表達(dá)不均衡。MYB1R1基因具有部分生物鐘的節(jié)律功能，并可能參與干旱信號(hào)傳導(dǎo)。本文在蘭科植物里第一次提供了MYB1R1基因參與光周期和干旱脅迫的表達(dá)研究數(shù)據(jù)。
　　5.同

13、步提取RNA和多糖的技術(shù)。以霍山石斛愈傷組織、愈傷組織和原球莖為材料，提取材料中RNA后，收集提取過(guò)程中的廢棄物進(jìn)行多糖提取。結(jié)果顯示RNA提取質(zhì)量符合基因表達(dá)研究的需要，而且提取的多糖可以與標(biāo)準(zhǔn)的多糖提取具有穩(wěn)定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，使原位并實(shí)時(shí)研究基因表達(dá)和多糖分析成為可能。
　　綜上所述，本研究改進(jìn)了霍山石斛的離體培養(yǎng)條件，揭示了培養(yǎng)條件下霍山石斛培養(yǎng)物多糖含量的變化規(guī)律，克隆了生物鐘相關(guān)基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，在長(zhǎng)時(shí)間尺度和短時(shí)間