水稻(oryzasatival.)nadpme4基因表達(dá)與非生物脅迫關(guān)系研究

1、學(xué)校代碼：1 0 2 2 5學(xué) 號(hào)：S 1 5 6 0 0學(xué)位論文水稻( O r y z a s a t i v aL ．) N A D P —M E 4 基因表達(dá)與指導(dǎo)教師姓名：申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：論文提交日期：授予學(xué)位單位：非生物脅迫關(guān)系研究陳莉敏柳參奎教授碩 士2 0 1 5 年0 4 月東北林業(yè)大學(xué)東北林業(yè)大學(xué)學(xué)科專業(yè)： 生物化學(xué)與分子生物學(xué)論文答辯日期： 2 0 1 5 年0 6 月1 4 日授予學(xué)位日期：答辯委員會(huì)主席：論文評(píng)閱人

2、：聾j r ． 大學(xué)摘要摘要N A D P ．蘋(píng)果酸酶是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物以及原核和真核生物體內(nèi)的氧化脫羧酶。在二價(jià)金屬離子( M 9 2 + 或M n 2 + ) 存在下催化蘋(píng)果酸氧化脫羧生成丙酮酸、C 0 2 和N A D P H 從而參與植物體內(nèi)不同的代謝途徑。植物體中N A D P ．M E 以同功酶的形式存在，由一個(gè)多基因家族編碼，定位于細(xì)胞的質(zhì)體和胞質(zhì)中。本研究以水稻N A D P ．M E 4 ( N C B I ：

3、N M0 0 1 0 5 0 7 5 4 ) 基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)B i o e d i t 、M E G A 3 ．1 對(duì)多種植物體內(nèi)N A D P —M E 同源性及進(jìn)化關(guān)系分析結(jié)果顯示N A D P —M E 4 與胞質(zhì)型A t N A D P ．M E l 、Z m c y t M E 的同源性較高，分別為7 9 ％、9 0 ％，且在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分布上與二者位于同一分支，而A t N A D P ．M E l 、Z m c y t

4、 M E 均特異性的在根中表達(dá)，同一分支的N A D P 。M E 4 也可能是胞質(zhì)型非光合基因，且與根中的代謝關(guān)系較為密切。通過(guò)對(duì)N A D P ．M E 4 ．G F P 轉(zhuǎn)基因擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的觀察顯示融合蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中，是水稻N A D P ．M E 基因家族胞質(zhì)型成員中的一個(gè)。N A D P —M E 4 基因啟動(dòng)子序列中除包含基本元件T A T A ．b o x 和C A A T - b o x 外，還存在1 個(gè)根

5、特異性元件( m o t i f I ，．3 0 b p ~ - 4 0 b p ) ，一個(gè)胚乳表達(dá)相關(guān)的元件( S k n ．1 m o t i f ，．1 2 4 7 b p ~ ．1 2 5 3 b p ) 及多種與環(huán)境誘導(dǎo)相關(guān)的元件( 光、干旱、水楊酸、A B A ) ，實(shí)驗(yàn)中克隆了N A D P ．M E 4 基因啟動(dòng)子片段連G U S 報(bào)告基因，并得到轉(zhuǎn)基因擬南芥，通過(guò)定量P C R 檢測(cè)到G U S 基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥各組

6、織器官中的表達(dá)量較低，其中在根中表達(dá)量稍高，但也僅為對(duì)照組的0 ．1 倍。說(shuō)明N A D P ．M E 4 基因啟動(dòng)子具有較低的活性，該基因在植物體內(nèi)是低水平的組成型表達(dá)，且其表達(dá)可能受多種逆境環(huán)境因子誘導(dǎo)。為了研究該基因與逆境環(huán)境是否存在響應(yīng)關(guān)系，使用不同濃度N a C l 、P E G 6 0 0 0 、N a H C O ，對(duì)水稻幼苗進(jìn)行脅迫處理1 2 h 后，定量P C R 檢測(cè)顯示水稻幼苗葉中N A D P ．M E 4 基因

7、的表達(dá)量是降低的，而在根中該基因表達(dá)量顯著增加，尤其在3 0 m MN a H C 0 3處理時(shí)，根中基因表達(dá)量增加到3 倍。對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥三個(gè)株系及野生型進(jìn)行不同濃度的N a C l 和M a n n i t o l 脅迫處理1 4天后，過(guò)表達(dá)N A D P ．M E 4 基因擬南芥的三個(gè)株系在根長(zhǎng)、鮮重、葉綠素含量生理指標(biāo)上表現(xiàn)出比野生型較好的狀態(tài)。這說(shuō)明N A D P ．M E 4 基因參與植物體對(duì)鹽和滲透脅迫的防御反應(yīng)，提高轉(zhuǎn)基