pbmc分離及凍存流程

1、PBMC 分離及凍存流程PBMC 分離及凍存流程 分離及凍存流程本實(shí)驗(yàn)采用密度梯度離心原理（Ficoll 密度為 1.077，PBMC 平均密度為 1.072） ，并通過(guò)反復(fù)離心洗滌，獲得相對(duì)較純的 PBMC。1. 試劑與耗材 試劑與耗材DPBS (PH=7.4, GIBCO, C14190)，RPMI 1640 (GIBCO, C22400)，F(xiàn)BS (GIBCO,10099)，F(xiàn)icoll 分離液（LymphoprepTM, 11

2、14740） ，臺(tái)盼藍(lán)（Sigma, 117K2332） ，DMSO(Sigma, D5879-1l)，15ml 和 50ml Falcon 離心管2. 緩沖液配置 緩沖液配置P0：即不含 FBS 的 PBSR0：即不含 FBS 的 RPMI 1640R10：即 10%FBS 的 RPMI 1640凍存液： 凍存液：即含 10%DMSO 的 FBS所有液體配置后 4°Ｃ保存，使用前 30 分鐘平衡至室溫。3. 分離步驟（以每

3、份血樣 分離步驟（以每份血樣 25ml 為例） 為例）1) 在分離前 30 分鐘，準(zhǔn)備超凈臺(tái)，將緩沖液(P0, R10)和 Ficoll 分離液復(fù)溫至室溫；每個(gè)患者 20ml 的肝素鈉抗凝血（綠色帽管），需要 50ml 離心管 2 個(gè)，15ml 離心管 3~4 個(gè)2) 登記樣本基本信息，姓名，ID 號(hào)，采血日期； 3) 650g 離心 7min，30ml 血一共可留取 3~4ml 血漿（2ml ep 管 圓底的 3 管）,以盡量不吸取到

4、紅細(xì)胞為原則，注意無(wú)菌操作，巴斯管不能伸進(jìn) ep 管。4) 吸取的血漿離心 3000rpm，10min，吸取上清。5) 每位患者需要分裝為 4 管血漿（1.5ml ep 管），血清視情況（10ml 普通帽管）而定，1.5ml 離心管每管 1ml；5ml 普通管中吸出 300~400ul 到 1.5ml EP 管中，標(biāo)記后和HBV DNA 申請(qǐng)單卷在一起，然后把 5ml 的普通管與雅培申請(qǐng)單卷在一起，送到血清室，反別放入相應(yīng)的盒子中（盒

5、子在臺(tái)上或在透明玻璃門(mén)冰箱里），血清血漿放到小實(shí)驗(yàn)室臥室冰箱中。6) 在 50ml 離心管中，加入 PBS（2 倍稀釋），用巴斯管反復(fù)混勻剩下的血，倒入離心管中，反復(fù)混勻再轉(zhuǎn)移至加入 5ml Ficoll 分離液的 15ml Falcon 離心管 3 或 4 管（這樣的分離效果會(huì)均勻一些，避免有一些管 PBMC 多一些）7) 個(gè)別患者離心完第 1 步之后可能會(huì)呈現(xiàn)云霧狀細(xì)胞團(tuán)，吸取 PBMC 之后吹散即可，離心完第 2 步之后一定要徹底

6、打散細(xì)胞。）8) 將稀釋的血液緩慢加入 Ficoll 分離液的表面（傾斜 45 度）；9) 按程序 1 離心(800 g，25 分鐘，室溫，加速/減速設(shè)置為 1)；PBMC 分離及凍存流程10) 輕柔的收集淋巴細(xì)胞帶置于新的 50ml Falcon 離心管（1 支），并加入 PBS 至 50ml；盡量避免吸到分離液。11) 按程序 2 離心(1800 rpm，10 分鐘，室溫，加速/減速設(shè)置為 9)；12) 棄去上清，輕彈管底打散細(xì)胞沉

7、淀，并將細(xì)胞在 4ml R10 及 16ml PBS 中重新混懸；13) 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(吸取 20ul 細(xì)胞懸液到計(jì)數(shù)板中，human fresh PBMC，稀釋 20 倍，校正)；等記，每 5~8×106 個(gè)細(xì)胞為一管14) 按程序 3 進(jìn)行離心(1500 rpm，10 分鐘，室溫，加速/減速設(shè)置為 9)；15) 棄去上清，輕彈管底打散細(xì)胞沉淀，按下一步實(shí)驗(yàn)要求用凍存液調(diào)整細(xì)胞濃度或凍存。4. 凍存步驟 存步驟1) 預(yù)先配制

8、相應(yīng)體積的凍存液，置 4℃冷卻；2) 在凍存管上標(biāo)記樣本姓名，凍存日期；3) 接上述第 15 步，按 6~8*106/ml 密度計(jì)算凍存管數(shù)，按 1ml/tube 添加凍存液；4) 將添加凍存液的細(xì)胞輕柔混勻后，1ml/tube 分裝至細(xì)胞凍存管；5) 將凍存管置于細(xì)胞梯度凍存盒，后者置于-80℃冰箱（4 號(hào)） ；5. 注意事項(xiàng) 注意事項(xiàng)1) 全過(guò)程無(wú)菌操作，動(dòng)作輕柔細(xì)致；2) 實(shí)驗(yàn)前必須將各種緩沖液和 Ficoll 平衡至室溫，有必要